基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在血培养阳性标本鉴定方面的应用进展

赵冠华，张霄霄，汪定成，董 轲 综述，张惠中 审校(第四军医大学唐都医院检验科，西安 710032)



·综 述·

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在血培养阳性标本鉴定方面的应用进展

赵冠华，张霄霄，汪定成，董 轲 综述，张惠中△审校(第四军医大学唐都医院检验科，西安 710032)

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱； 血培养； 鉴定

如今，随着抗菌药物特别是广谱抗菌药物的广泛应用，细菌耐药问题已逐渐成为全球性问题。怎样及时而有效地选择抗菌药物成为临床医生面临的一个难题。特别是在菌血症或是脓毒症等严重感染患者中，早期选用敏感抗菌药物可以有效降低病死率[1]。但传统的细菌鉴定多采用手工法，依靠形态学、革兰染色镜检和生物化学反应，速度慢，不能满足临床诊断和治疗的需要。近年来新发展起来的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)为细菌鉴定带来了新的进展，特别是MALDI-TOF MS技术对血培养阳性标本直接鉴定的应用，可以将原有血培养阳性标本的鉴定时间由24～48 h缩短为几十分钟(含标本预处理所用的时间)，为临床用药提供了更及时的指导。本文就MALDI-TOF MS在血培养阳性标本鉴定方面取得的进展予以综述。

1 MALDI-TOF MS技术直接鉴定血培养标本

1.1 细菌的鉴定 临床上送检的血培养标本多来自血液或是无菌部位的体液，培养阳性一般意味着患者感染严重，需要及时治疗。但是微生物实验室常规采用的传统手工方法或是借助半自动仪器，都需要24～48 h才能对病原菌进行鉴定，影响临床及时选用有效的抗菌药物。

La Scola和Raoult[2]首先在2009年提出用三氟乙酸或蚁酸裂解菌体蛋白质的方式直接检测血培养阳性的标本。在使用三氟乙酸处理后，对于562例只包含一种病原菌的血培养阳性标本，有370例(66%)可以被正确识别。但是对草绿色链球菌的鉴别能力较差，大多不能鉴定，鉴定出的1例也被证明是假阳性。而对于22例含有两种或两种以上不同的细菌的阳性血培养标本，有18例标本鉴定出了一种细菌，2例标本不能鉴别，另外2例标本鉴别错误。

随后，大量的研究表明，MALDI-TOF MS可以直接对血培养标本进行鉴定，从而省去了转种于培养基上孵育的时间。Romero-Gomez等[3]和Meex等[4]均认为MALDI-TOF MS对革兰阴性细菌的鉴别能力远远强于对革兰阳性菌的鉴别能力。Romero-Gomez等[3]采用MALDI-TOF MS对324例单一菌血症血培养阳性标本进行鉴定，其中革兰阴性菌257株，革兰阳性菌67株。MALDI-TOF MS可以直接鉴定肠杆菌的有97.7%，非发酵革兰阴性杆菌的有75%，金黄色葡萄球菌的有75.8%，凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)和肠球菌的有63.3%。Meex等[4]认为对于含有单种细菌标本的革兰阳性菌，Sepsityper试剂盒和使用皂角苷处理在种的水平可以正确鉴定58%和52%的细菌。对革兰阴性菌，MALDI-TOF MS的Sepsityper试剂盒和皂角苷的方法分别可以在82.5%和90%的水平正确鉴定到种。

针对文献报道的MALDI-TOF MS对葡萄球菌和链球菌的鉴定可信度较差的问题，多个研究也已经进行了探索。Dupont等[5]、Kilic和Baysallar[6]以及Lopez等[7]使用MALDI-TOF MS针对特定细菌的鉴别进行了研究。Dupont等[5]对临床分离的20种234株CNS用MALDI-TOF-MS、Phoenix和VITEK-2 三种系统分别鉴定，鉴定的总体正确率分别为93.2%、75.6%和75.2%。Kilic和Baysallar[6]认为对于研究中69例患者的96个含革兰阳性球菌的血培养阳性标本，MALDI-TOF MS可以对金黄色葡萄球菌鉴定到属和种的水平为100%，对CNS鉴定到属和种的水平为96.6%。Lopez等[7]比较了MALDI-TOF MS和API20系统对草绿色链球菌的鉴别能力，对124例含草绿色链球菌的血培养阳性标本进行鉴定后发现，API20系统和MALDI-TOF系统鉴定到种的准确性分别为60.5%和73.4%，鉴定到属的准确性分别为70%和94.3%。

Justesen等[8]和Bess等[9]则分别对MALDI-TOF MS鉴别厌氧菌和空肠弯曲菌属的情况作了研究。Justesen等[8]对13个属(主要是拟杆菌属、梭状芽孢杆菌、梭杆菌属、乳杆菌属、韦荣菌属、痤疮丙酸杆菌等)39个种的120例含厌氧菌的标本进行了鉴定，MALDI-TOF MS可以准确鉴定到种的水平分别为70例(58.3%)和60例(50%)。Bess等[9]用传统方法、分子生物学方法(实时PCR测序)和MALDI-TOF MS方法对1 007例含空肠弯曲菌的临床标本进行鉴定，并把分子生物学方法作为金标准。MALDI-TOF MS方法鉴定空肠弯曲杆菌空肠亚种的准确性为99.4%，空肠弯曲杆菌空肠亚种以外的空肠弯曲菌的准确性达到了100%。

对于不同研究中，MALDI-TOF MS方法对细菌鉴定准确率不同的原因，目前尚缺乏明确的观点。有文献认为不同的仪器和系统也可能对MALDI-TOF MS的鉴别能力产生影响。Chen等[10]对法国生物梅里埃Vitek MS IVD和布鲁克道尔顿的Microflex LT Biotyper两种系统直接鉴定血培养阳性标本的情况进行比较，两种系统都联合应用Sepsityper试剂盒，对于181例单一病原菌的血培养阳性标本，Biotyper系统和Vitek MS IVD系统分别鉴定到种属的水平为177株(97.8%)和167株(92.3%)。通过两个系统对病原菌的鉴定，作者认为Biotyper系统比Vitek MS IVD系统有更准确的鉴定能力(P=0.016)。

现有的文献表明，MALDI-TOF MS技术可以快速、准确地对血培养阳性标本进行直接鉴定，为临床的诊治提供快速、可靠的依据。各个研究间MALDI-TOF MS技术对血培养阳性标本直接进行鉴定的准确性不同是由多种因素引起的，如样本量的大小、研究中各种病原菌所占的比例、预处理试剂和程序的差别、使用不同的系统等。另外，许多试验只对限定的一种或多种病原菌进行鉴定，缺少盲法也会对结果产生不同程度的影响。

1.2 真菌的鉴别 由于免疫抑制剂的大量使用和临床收治危重患者的增多，真菌感染在临床送检标本中也不断增加。MALDI-TOF MS技术的不断发展也实现了直接对血培养阳性标本中真菌的鉴定。Marinach-Patrice等[11]较早尝试直接从阳性血培养标本中鉴定酵母菌，以减少1～3 d转种培养时间对临床调整治疗带来的不利影响。Marinach-Patrice等[11]先将白色念珠菌接种于血培养瓶，再用MALDI-TOF MS对标本进行分析，以建立质谱指纹数据库。最后用单独的模拟血液培养阳性的36个标本(属于6个菌种)进行验证，初步证实了方法的可行性。

随后有文献报道，MALDI-TOF MS可以很好地对含真菌的血培养阳性标本进行鉴别。Yan等[12]对42例含单种酵母菌的血培养阳性标本进行了鉴定，认为MALDI的Biotyper系统加上应用Sepsityper标本处理程序可以正确识别42例标本到种的水平，包括28株(66.7%)白色念珠菌、8株(19%)近平滑念珠菌，5株(11.9%)热带念珠菌和1株(2.4%)新型隐球菌。除此之外，还摸索出了血培养中酵母的直接检测低限为5.9×105CFU/mL(种内变异系数为1.8%～3.6%，种间变异系数为2.9%)。Spanu等[13]对罗马的2个生物实验室进行的观察性研究表明，MALDI Biotyperr系统可以对血培养阳性标本中的酵母菌直接在种的水平鉴定，研究中MALDI-TOF MS正确鉴定了195株白色念珠菌中的187株(95.9%)，148株非白色念珠菌中的128株(86.5%)。Yaman等[14]将MALDI-TOF MS与常规方法联合自动化Vitek 2 YST板进行对比，对281例血培养阳性的念珠菌进行鉴定，发现MALDI-TOF MS可以在种的水平100%正确鉴定281株临床分离的念珠菌。

有文献报道，MALDI-TOF MS对临床标本中丝状真菌的鉴别正确率达到85.9%[15]。但对于MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性标本中的丝状真菌，目前文献报道的相对较少，这可能是由于血培养阳性标本中分离的丝状真菌数量和种类较少，缺乏相关的研究造成的。

2 直接检测细菌的耐药性

MALDI-TOF MS技术应用于临床病原菌的检测后，不能对病原菌进行药敏检测成为其明显的不足。但随后不断有文献报道通过各种改良方法直接对病原菌进行药敏测定。目前，对血培养阳性细菌直接进行耐药性的鉴定主要集中在β-内酰胺酶活性和对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性检测。Neumaier等[16]将氨苄西林作为耐β-内酰胺酶活性大肠杆菌菌株的替代指标，通过将血培养阳性标本中的菌液与氨苄西林培养液共同培养后，用MALDI-TOF MS区分耐氨苄西林的大肠杆菌，精度高达100%，这种方法也得到了认可。Sparbier等[17]通过将血培养阳性标本中的少量菌液(1 mL)经过Sepsityper配套试剂盒处理后，与相应的抗菌药物培养液(大肠杆菌用氨苄西林、肺炎克雷伯菌用厄他培南)共同培养3 h，通过质谱仪测定两种细菌的峰值并与标准对比来判断其β-内酰胺酶活性。Oviano等[18]对141例(13例菌血症、128例接种了临床分离菌)血培养阳性的标本进行了研究，通过使用抗菌药物头孢噻肟、头孢他啶来判断细菌β-内酰胺酶的活性，研究中添加了克拉维酸以排除非耐药机制的存在。通过测量峰谱，对血培养肠杆菌科细菌中ESBL检测的灵敏度高达99%。Carvalhaes等[19]对100例随机选择的血培养阳性标本进行检测，发现在与抗菌药物共同孵育4 h后，可以检测29例碳青霉烯类耐药标本中的21例，正确率达72.4%，特别是对于KPC-2基因和SPM-1基因所编码耐药性的菌株，达到100%。而对于OXA-23基因编码的鲍曼不动杆菌菌株虽然不能在第1天发现，但可以对其转种培养的菌株全部正确检测。

3 MALDI-TOF MS技术对临床指导意义的研究

MALDI-TOF MS技术对于临床病原菌鉴定的重要性就在于可以及早对细菌进行鉴定，指导临床的用药。但是由于目前推广的主要是对病原菌种类进行鉴别，不能直接进行药物敏感试验。对检测结果的提速对于临床指导的重要性尚存在一些疑问。部分文献针对MALDI-TOF MS的引入是否可以缩短经验性广谱抗菌药物的持续时间和是否有利于更快治疗患者进行了相关研究。Glans等[20]研究了实验室引入MALDI-TOF MS前后两个阶段的情况并进行了分析。引入前有42例患者的60例血培养阳性标本纳入了分析，引入后有57例患者的80例血培养阳性标本纳入了分析。通过分析细菌鉴定对临床用药的影响后发现，多数患者开始经验性治疗时使用一种广谱抗菌药物，使用MALDI-TOF MS进行细菌鉴定后，发送的报告缩短了感染患者的广谱抗菌药物治疗时间，与革兰阴性菌相比，革兰阳性菌缩短的时间更明显(从18.6 h减少到10.5 h)。同时，MALDI-TOF MS的使用，也能够更快地判断血培养阳性是否只是一种污染，从而终止非必要的治疗。Hodiamont等[21]通过对73例连续血培养阳性的患者用药情况进行分析后得出结论，MALDI-TOF MS对病原菌的鉴定结果可以使多达29%的患者用药得到调整，因此可以作为临床诊治的有效辅助诊断技术。Clerc等[22]对革兰阴性菌的菌血症患者进行了前瞻性的研究，认为对于超广谱β-内酰胺酶(ESBL)和多重耐药低流行的革兰阴性菌的地区，MALDI-TOF MS对血培养阳性的革兰阴性菌血症的鉴定可以使多达35.1%(71/202)的患者用药得到调整。

总的来说，这种与临床相关的研究有很大实用价值，对MALDI-TOF MS的推广使用也更有说服力。但目前相关研究还比较少，降低了其证据的支持力。与之相比，大规模多中心的临床研究，特别是包含治疗费用、住院时间等综合因素的研究，更有指导性。

4 MALDI-TOF MS相关的探索性研究

4.1 预处理方法的比较 各篇文献所报道的对血培养阳性标本直接鉴别的正确鉴别能力不同，可能与血培养阳性标本预处理方法不同相关。Saffert等[23]评估了分析前差速离心、10%烷基硫酸钠(SDS)和Sepsityper试剂盒3种预处理方法处理血培养阳性标本对于MALDI-TOF MS鉴定细菌的影响。鉴定属和种的临界值分别取系统规定的分数1.700～1.999和大于或等于2.0。通过差速离心处理的79例血培养阳性标本鉴定到属和种的水平正确例数分别为51例(65%)和34例(43%)。用SDS和Sepsityper试剂处理的101例标本鉴定到属的水平均为77例(76%)，鉴定到种的水平分别为49例(49%)和54例(54%)。

4.2 混合菌鉴定 MALDI-TOF MS应用于临床细菌的鉴别以来，大量的文献都表明这种技术尚不能用于混合细菌的鉴定。而Wenzel等[24]则在研究中使用新的方法和计算程序为实时检测混合细菌标本提供了可能。其先制备了不同比率的细菌混合物，使用MALDI-TOF MS(Biotyper 2.0)软件分析。同时，用一种新的程序比对混合细菌的质谱图，建立混合细菌相关数据库，一些两种细菌混合生长的标本，包括人工制备和血培养得到的标本，在使用新建立的混合菌的数据库和计算程序后，可以被正确鉴别。这项研究提出了应用新的计算程序和新的数据库直接检测混合感染的血培养标本的新思路。

4.3 探索最小鉴别浓度 Maier等[25]通过在血培养瓶中接种细菌或酵母的方法探索MALDI-TOF MS可以直接鉴定血培养标本中的最低浓度。使用MALDI-TOF MS质谱仪联合Biotyper软件对标本进行鉴定，可以鉴别浓度为107CFU/mL或以上的标本。对于不同种类的细菌(大肠杆菌、革兰阴性非发酵菌、葡萄球菌、肠球菌、链球菌、嗜血杆菌)均能可靠鉴定。先前文献报道的不能检测酵母菌的情况在研究中显示可以鉴定。在某些情况下，甚至有可能在血培养阳性报警1～2 h前准确鉴定，显示出较高的灵敏度。但在大多数情况下，混合培养的病原菌仍然不能鉴别或只有一种鉴别结果。

4.4 比较延迟检测的影响 Schieffer等[26]采用MALDI-TOF MS联合Sepsityper试剂盒通过延迟对血培养阳性标本处理的办法，模拟在室温条件下可否将标本送到另一个实验室进行检测。试验表明，延迟对血培养阳性标本的处理没有影响Sepsityper提取标本或MALDI-TOF MS对血培养阳性标本直接鉴定的准确性。研究表明在临床上，可以在室温下将标本送到另外的实验室进行检测。

5 前景与展望

作为一种新兴的诊断方法，MALDI-TOF MS技术在国外正在推广，而在国内的应用还不是非常广泛。从文献报道的情况来看，对各种标本的预处理和操作程序缺乏统一的规范，对菌种鉴定的准确性缺乏统一的意见。像其他新兴的诊断技术一样，MALDI-TOF MS不能完全取代手工方法和传统技术对于病原菌的鉴定。特别是在直接鉴定血培养阳性标本方面，其准确性和可靠性还需要临床检验工作的进一步验证。但是，这项技术对于病原菌鉴定的发展意义重大。直接鉴定血培养阳性标本带来的时间效益已是不争的事实，对于临床治疗的重要性和带来的经济效益已在研究之中。对于临床上遇到的一些苛养菌或是罕见的致病菌，MALDI-TOF MS的引入可以方便快捷地进行鉴定。如Holler等[27]在2011年报道了1例软弱贫养菌导致的心内膜炎，此后，陆续有文献报道了类鼻疽伯克菌[28]、纽氏放线菌[29]、涅斯捷连科菌[30]、香港鸥杆菌[31]、贪铜菌[32]等导致的菌血症。这对在临床工作中一些常规方法不能鉴定的病原菌标本提供了新的思路。目前，MALDI-TOF MS在细菌耐药性直接检测的功能已经崭露头角，对混合细菌的检测也有望成为现实。相信随着数据库的不断完善、软件的不断更新、影响因素的不断明确，MALDI-TOF MS可以为临床提供更快、更准的信息，为临床医疗提供参考。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.069

A

1672-9455(2015)18-2801-04

2015-03-16

2015-04-12)

△通讯作者，E-mail:huizz328@163.com。