超高效液相色谱在中药及其复方研究中的应用进展

盈竞男 韩新民

（南京中医药大学，江苏南京210029）

超高效液相色谱 （ultra performance liquid chromatography，UPLC）法是指一种采用小颗粒填料色谱柱（粒径小于2μm）和超高压系数（压力大于105kPa）的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，因此特别适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究[1]。中药及其复方作为中医临床用药的主要形式，体现了中医整体观和辨证论治的特色，具有多成分、多途径、多靶点发挥药效的特点。且作为一个高度复杂的化学物质体系，其复杂性不仅表现在组成方剂的化学成分的复杂性及各组分相互关系的复杂性，也体现在方剂与人体相互关系的复杂性[2]。现对近几年来超高效液相色谱在中药及其复方研究中的应用综述如下。

1 UPLC法评价中药及其复方提取工艺

邓少东等[3]以UPLC法测定酸水解前后化橘红中4种黄酮类成分的含量，均达到良好的分离，认为该法高效、快速、灵敏。刘萍等[4]采用UPLC法测定不同提取工艺提取钩藤中钩藤碱含量，结果表明超临界CO2萃取方法能在接近常温条件下工作，提取出的钩藤碱含量高。王店云等[5]使用UPLC采用正交试验法，考察安神定志灵在不同加水量、煎煮时间、煎煮次数下的煎出液中黄芩苷的含量变化规律，确定安神定志灵的最佳煎煮工艺条件。李坤平等[6]采用超高效液相色谱/电喷雾飞行时间质谱联用技术（UPLC/EST-TOF-MS）对玉屏风方的水煎煮和超声提取物的主要化学成分进行分析，发现水煎煮和超声得到的2种提取物的色谱图共有峰12个，相对保留时间一致，说明2种方法的提取物化学成分基本相同，就提取物化学成分而言，超声提取技术适用于玉屏风方的制剂生产。陈杨等[7]运用正交试验法优选黄浦通窍胶囊的提取工艺，以浸膏得出率、浸膏中大黄和石菖蒲有效成分为综合评定指标，采用UPLC法，得出该制剂最佳提取工艺。汪永忠等[8]使用UPLC法，对阳和平喘颗粒的提取工艺进行研究，通过分析正交实验设计法的结果，得到8倍量的80%乙醇加热回流提取2次，每次1.5h的最佳提取工艺。赵祥军等[9]使用UPLC法，以5种生物碱的总量作为评价指标，对左金丸的水提、70%乙醇提取、盐酸-甲醇（1∶100）提取、半仿生提取方法进行比较，认为盐酸-甲醇（1∶100）提取方法优于其他3种。

运用UPLC法对各提取工艺进行比较，不仅能提高分析效率，节省分析时间，减少溶剂损耗，降低分析成本，更能优化总结出最佳提取方案，为中药及复方的质量标准建立和药效学研究奠定了良好的基础。

2 UPLC法测定中药及其复方有效组分成分、含量

卢林等[10]采用UPLC法测定地黄中梓醇的含量，在最优化条件下，梓醇与其他峰均能达到基线分离，其色谱峰形好，梓醇的含量在3.06～18.36μg时与峰面积呈良好的线性关系。闫利利等[11]利用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪联用技术（UPLC/Q-TOF-MSE）在相同实验条件下对半夏泻心汤及其组方各单味药的色谱图进行比较分析，鉴定了74个色谱图，主要成分包括黄酮类、三萜皂苷类、生物碱类、糖苷类，较全面地阐明半夏泻心汤的化学组分，为半夏泻心汤的药效物质基础研究和质量控制奠定了基础。岑卫健等[12]采用UPLC-MS/MS法同时测定益气养血口服液中淫羊藿苷、黄芪甲苷、黄芪甲苷Ⅱ、五味子醇甲和麦冬皂苷D 5种有效成分含量。在最优化条件下，用Agilent Zorbax RRHD E-clipse Plus C18色谱柱，流动相为乙腈和0.2%甲酸的水溶液，梯度洗脱，各组分的线性范围分别为0.003～12mg/L、0.3～12mg/L、0.009～18mg/L、0.006～12mg/L、0.003～3.0mg/L； 检出限分别为 1μg/L、1μg/L、3μg/L、2μg/L、1μg/L。 何丹等[13]应用 UPLC 法测定藿香正气口服液中尿苷、鸟苷和腺苷含量，其以ACQUITY UPLC BEH C18为色谱柱，流动相为水-甲醇梯度洗脱，柱温30℃，体积流量0.5mL/min，检测波长为254nm，分析得到尿苷在 10.29～102.9μg/mL、鸟苷在5.73～57.3μg/mL、 腺苷在 5.03～50.3μg/mL 范围内线性关系良好。陈晓虎等[14]利用UPLC同时测定栀子金花丸中11种成分，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱，被测定的11种成分色谱峰均有良好的分离度，且有较宽的线性范围和良好的线性关系。张紫佳等[15]运用UPLC测定青娥丸中松脂醇二葡萄糖苷的含量。样品经前处理后，采用ACQUITY UPLC BEH C18柱分离，以乙腈-水（使用磷酸调pH值至4.0，9∶91，v/v）为流动相，流速为0.1mL/min，检测波长为227nm，柱温为25℃，进样量为0.5μL，松脂醇二葡萄糖苷在1.40～506.00mg/L范围内呈现良好的线性关系。施玉旋等[16]以UPLC法测定“柴胡-白芍”药对提取物的3中皂苷类成分。方法是采用Waters XSELECTTM HSS T3色谱柱，0.1%H3PO4水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，柱温30℃，流速0.4mL/min，检测波长210nm，分析认为芍药苷、柴胡皂苷a及柴胡皂苷d三种成分基本分离，线性关系良好。

在中药及复方化学成分分析中，经常出现样品含量少，分离难度大，分析耗时长的情况，UPLC法能保证分析速度快，分离效率高，检测灵敏度高，精密、准确，更适合应用于有效成分及含量的分析。

3 UPLC法检测中药及其复方的代谢产物

王钰等[17]采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析大鼠灌胃白花蛇舌草环烯醚萜类提取物后尿液中的E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯（M0）及其代谢产物，在大鼠尿液中检测到M0、M1（E-6-O-对香豆酰鸡屎藤苷甲酯葡萄糖醛酸化产物）、M2（对香豆酸）、M3（对香豆酸硫酸化产物），其中M1和M3均为首次发现，分析得到M0在大鼠体内以葡萄糖醛酸形式代谢，最终以对香豆酸及香豆酸硫酸化产物排出体外。薛璟等[18]采用大鼠在体肠灌流实验，利用UPLC法测定雷公藤甲素的量，分别研究吸收部位和药物浓度对雷公藤甲素吸收的影响。研究结果表明4.8、3.20pmol/L雷公藤甲素灌流液在各肠段的有效渗透系数和10cm肠段吸收百分比（10cm%ABS）依次为：十二指肠＞结肠＞空肠＞回肠，各肠段之间无显著性差异（P＞0.05），不同质量浓度（4～20μmol/L）的雷公藤甲素在肠道内的吸收无显著性差异（P＞0.05）。苗华等[19]基于UPLC-代谢组学技术和预防性给样法研究泽泻提取物（AR）结合有氧运动对高脂血症的影响，结果显示不仅AR结合有氧运动对高脂血症有一定的治疗作用，且二者联用的治疗效果优于单一AR组或有氧运动组。郑林等[20]给大鼠静脉注射和口服细辛-芍药提取物后，用UPLC-MS同时测定大鼠血浆中野黄芩苷和芍药苷含量，研究2种指标成分在大鼠体内的药动学特征及其绝对生物利用度。结果表明，野黄芩苷和芍药苷2种成分呈良好的线性关系（r＞0.999），绝对生物利用度分别为26.448%和5.38%。辛杨等[21]以黑顺片单煎液及其复方煎煮液“术附汤”和“甘草附子汤”灌胃，以大鼠血浆中的次乌头碱为检测指标，采用UPLC/Q-TOF MS方法，并以内标法对其进行了含量测定，方法学考察结果表明血中次乌头碱在0.02～10ng/mL范围内呈现良好的线性关系，而“甘草附子汤”中的某种或某些成分促进了次乌头碱的体内吸收，两复方功效差异可能来源于次乌头碱在体内吸收的不同。

运用UPLC法，可通过分析中药及复方在体内代谢成分，探索其药效作用的更直接作用成分，为进一步阐明其物质基础提供研究方向。

4 UPLC法建立中药及其复方的指纹图谱

马培等[22]利用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱，乙腈-0.5%乙酸水溶液梯度洗脱，流速为0.3mL/min，紫外吸收波长为290nm，建立了38批不同产地虎杖药材的UPLC指纹图谱。结果显示该批次虎杖药材共有11个共有峰，其中4个共有峰为虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和大黄素甲醚。36批虎杖药材相似度＞0.9，2批药材相似度为0.733、0.896。刘芷等[23]首次建立了五味子的UPLC指征指纹图谱共有模式，标定了21个共有峰，结合保留时间和紫外光谱分析，指认了五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子γ乙素、五味子乙素和五味子丙素的峰位。19批五味子的相似度均在0.970以上。王露黔等[24]采用UPLC-PDA-ELSD法建立消渴颗粒的指纹图谱，分别以芒果苷和知母皂苷BⅡ为参照峰，确定了23个紫外检测共有指纹峰和10个蒸发检测共有指纹峰。结果证实19批消渴清颗粒合格，9批不合格；8批消渴清颗粒中有5个主要成分的量有异常，定量测定与指纹图谱结果具有一致性，可作为消渴清颗粒的质量控制依据。张宁等[25]利用UPLC-MS对自制10批地黄饮子样品进行成分分析，共标定了30个共有色谱峰，通过与对照品的保留时间及一级质谱信息的比对，确定了马钱苷、松果菊苷、乌头碱、新乌头碱、五味子醇甲、五味子乙素和茯苓素，所制定的指纹图谱特征性及专属性强，可结合含量测定用于全面控制地黄饮子的质量。

目前，指纹图谱已经成为国际公认的中药或天然药物质量控制最有效的方法之一。近些年来色谱技术发展，超高效液相色谱具有较好的分离效率、峰容量及灵敏度，作为一种新的色谱技术应用于中药及复方指纹图谱的测定研究有着非常广阔的前景。

5 讨论

中药及复方具有组分多、有效成分含量低、各组分物理化学性质各异的特点，且大多对环境（如温度、pH值等）敏感。近年来随着分析化学和仪器设备的发展，一些新型的分析方法被应用到中药及复方研究领域中来，如化学定量法、紫外分光光度法、薄层扫描法、气相色谱法、高效液相色谱法等。化学定量法适用于单味中药制剂或复方中含量较高的一些成分及含矿物药制剂中的无机成分的含量测定，但其灵敏度低、操作烦琐、主属性差，故不适用于制剂中单体成分、微量及痕量的测定。紫外分光光度法是通过测定吸收度来计算含量的方法，该法灵敏度高、选择性好、操作简单，但是准确度相对不高。薄层扫描法进行定性分析，比较直观、快速、准确，但定量分析无论准确性、稳定性还是精密度上都不好，故已取消其定量分析。气相色谱具有分离能力好、灵敏度高、分析速度快、操作简单的优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都无法采用其进行分析。高效液相色谱法（HPLC）主要是利用要测定的指标成分与其他组分在流动相与固定相中的分配系数不同而把指标成分分离出来并进行含量测定，具有分离效率高、准确性和重现性好、分析速度快、选择性优和灵敏度高的特点，且不受样品挥发性的限制，对于高沸点、热源稳定性差的有机物都可应用。故目前在中药及其复方定性及定量研究方面，HPLC使用的最为广泛。超高效液相色谱（UPLC）基于HPLC技术，采用1.7μm颗粒度的色谱柱填料，能获得更高的柱效，并且在更宽的线速范围内柱效保持恒定，因而有利于提高流动相流速，缩短分析时间，提高分析通量，为复杂体系的分离分析提供了良好的平台。在分析结果的质量、时效性、成本等方面，UPLC较传统或优化的HPLC更出色，故越来越多的研究者采用超高效液相色谱。

随着药物分析方法的发展，UPLC将会在药物及其复方分析领域中发挥越来越重要的作用，其能够快速、精确的对中药及复方提取工艺进行优化，测定有效成分及含量，分析药物体内代谢产物，制定指纹图谱。但是UPLC在实际应用中也存在一些问题，如由于进样量过少，且采用半环进样的方式，导致峰面积的重复性略差，而且由于填料颗粒极细，导致UPLC柱易堵塞等。但是随着进样技术、填料技术等进一步发展，这些不足将会得到进一步克服。在实际研究过程中，许多研究者将UPLC与质谱联用，其高效性、高灵敏度能快速完成众多复杂成分的分离与鉴定，不仅能够做定性、定量检测，而且能够提供一些分子结构信息。因目前单体对照物有限，故在实验中对于某些不明的单体或新化合物不能马上明确其成分，可以以UPLC为分离系统，质谱为检测系统，二者联用经检测器得到质谱图，提供相对分子质量与结构信息，推算出其化学式，有助于明确其化学成分。通过联用技术既可建立中药及其复方的指纹图谱，又可进行多种有效成分或指标成分定量，还可用于体内药物分析，为我们研究中药及复方的有效成分及新药的开发提供物质基础。

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