手足口病患者柯萨奇病毒核酸检测结果分析*

王武琦，苏国生，韦善求(.广西壮族自治区玉林市中医医院检验科 537000；.广西壮族自治 区南宁市第四人民医院/广西医科大学附属南宁市传染病医院/广西艾滋病临床治疗中心，南宁53003)



·论 著·

手足口病患者柯萨奇病毒核酸检测结果分析*

王武琦1，苏国生2△，韦善求2(1.广西壮族自治区玉林市中医医院检验科 537000；2.广西壮族自治 区南宁市第四人民医院/广西医科大学附属南宁市传染病医院/广西艾滋病临床治疗中心，南宁530023)

目的 探讨手足口病患者柯萨奇病毒核酸检测的临床应用价值。方法 利用实时荧光聚合酶链反应技术，以EV71/CA16基因组编码区的高度保守区为靶区域，设定特异性引物及荧光探针，通过一步法RT-PCR扩增对EV71 RNA/CA16 RNA进行检测。结果 在428份患者标本中，EV71-RNA阳性136份，CA16-RNA阳性6份，其中有1例患者既是EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性又是CA16-RNA咽拭子阳性。而有40例(80份标本)患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性，46份EV71-RNA单独肛拭子阳性，10份EV71-RNA单独咽拭子阳性。在6份CA16-RNA阳性患者标本中，4份为肛拭子阳性，2份为咽拭子阳性。结论 手足口病患者柯萨奇核酸检测对重症患者判断预后有重要的指导意义，对指导临床合理制订治疗方案有重要的参考价值，值得推广应用。

手足口病； 柯萨奇病毒； 核酸检测； 基因

近几年来，玉林市手足口病的暴发流行有着逐年上升的趋势，并且已经成为当前玉林市儿童急性传染病的重要疾病，防控工作非常严峻。发病范围由点到面，迅猛增长，患病儿童病死率也呈逐年增高的发展趋势。由于手足口病的传播途径非常复杂，病原体种类繁多，且目前没有相应的疫苗可以预防，因此至今没有较好的预防控制措施[1-3]。手足口病是由多种肠道病毒感染引起的一种常见传染病，在核酸分型中主要以EV71型和CA16型最多见。多以婴幼儿发病最高，随着疾病的发展，10～18岁的儿童感染的概率也屡见不鲜，大多数患者发病症状较轻，以发热和口腔、手、足、臀部等部位的皮疹或疱疹为主要特征，部分患儿有咳嗽、恶心、呕吐、食欲不振、流涕和头疼等症状，少数患者可并发严重的心肌炎,无菌性脑膜炎以及肺水肿等致命性并发症[4-5]。广西医科大学附属南宁市传染病医院作为南宁市唯一一家综合性三级传染病医院，一直是本市手足口病的定点治疗医院。为了解2012年广西医科大学附属南宁市传染病医院柯萨奇病毒核酸检测的结果及临床应用，现将检测相关情况报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年在本院住院治疗的214例手足口病患儿咽拭子和肛拭子共计428份标本进行核酸检测，患儿年龄4个月至10岁，平均年龄1岁零8个月，男性多于女性，本年度感染高发期在4～8月。感染患儿以散居儿童为主，其次为幼托儿童，最后为学生。

1.2 核酸检测方法 利用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，以EV71/CA16基因组编码区的高度保守区为靶区域，设定特异性引物及荧光探针，通过一步法逆转录PCR扩增对EV71 RNA/CA16 RNA进行检测。

1.2.1 标本采集 (1)咽拭子样本：采集患者发病3 d内的咽拭子样本，用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3～5 mL保存液(维持液或生理盐水，推荐使用维持液)的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。(2)肛拭子样本：采集患者发病7 d内的肛拭子样本，采样方法同咽拭子。(3)疱疹液：可同时采集多个疱疹作为1份样本。先用75%乙醇对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3～5 mL保存液(维持液或生理盐水，推荐使用维持液)的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。(4)标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于-40 ℃待测，保存期为4个月。长期保存，请置于-70 ℃。标本运送时应采用0 ℃冰壶。

1.2.2 样本处理及RNA提取 (1)拭子样本强烈振荡1 min，取100 μL(待测样本不足100 μL时请补加适量生理盐水重悬)，放置于1.5 mL灭菌离心管，加入200 μL Trizol试剂及100 μL氯仿，用振荡器强力振荡20 s后静置3 min，然后12 000 r/min离心2 min。(2)小心取出无色上层液体(注意不可触及中间絮状层)，转移至新灭菌的1.5 mL离心管，然后加入10 μL RNA提取液A(充分混匀后吸取)，再用振荡器充分混匀，8 000 r/min离心1 min后，小心弃去所有液体。(3)加入溶液C(确认已加入无水乙醇)400 μL，充分振荡混匀，8 000 r/min离心1 min，尽可能将液体去除干净(避免触及沉淀颗粒)。(4)将装有沉淀的离心管摆在通风橱中风干15 min(也可使用开放式加热器于60 ℃ 干燥5 min，需防止样本交叉污染)，然后加入30 μL DEPC H2O，吸打混匀管中沉淀，得到白色的悬浊液，可直接用于检测，也可存于-70 ℃待用。

1.2.3 注意事项 PCR 荧光定量检测法比较容易受污染，所以试验过程中应尽量避免反复开盖，所用耗材均需高压灭菌；RNA 提取步骤建议冰上操作；吸取血清/血浆时注意勿带入红细胞；试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；RNA 提取液A必须充分混匀后吸取，RNA 提取液B需溶解混匀后使用；逆转录成 cDNA后，需马上进行下一步试验，否则请转移上清至灭菌EP管，保存于-20 ℃待用；试验完毕应用有效氯浓度为1 000 mg/L的健之素消毒液擦拭桌面，打开紫外线灯消毒 30 min以上。

2 结 果

在428份患者标本中，EV71-RNA阳性136份，CA16-RNA阳性6份，其中有1例患者既是EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性又是CA16-RNA咽拭子阳性。而有40例(80份标本)患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性，46份EV71-RNA单独肛拭子阳性，10份EV71-RNA单独咽拭子阳性。在6份CA16-RNA阳性患者标本中，4份为肛拭子阳性，2份为咽拭子阳性。在214例患者中有6例由于病情严重送入ICU进行治疗，有3例患者EV71-RNA咽拭子和肛拭子均阳性并有1例包含了CA16-RNA咽拭子阳性。此3例患者由于转入ICU后病情继续加重，医治无效病死，其余单纯1份标本EV71-RNA阳性患者病情好转救治成功。

3 讨 论

由柯萨奇病毒引起的手足口病是一种风险较高的传染病，其预防控制措施多以控制传染源为主，切断传播途径并进行广泛深入的手足口病防治健康教育，提高广大群众的自我保护意识[6]。当前本地区手足口病的防控工作主要还是切断传播途径、保护易感人群。在以往经验和防控措施的基础上，进一步完善各项防控措施，坚持不懈抓落实。加大传染源归口管理，严格按照规定隔离患者和疑似患者，减少接触传播，减少第2代患者发生；加强区域小学及托幼机构的管理，坚持晨检和消毒工作，发现可疑病患需及时报告并隔离；加强手足口病的防治宣教工作，将防控措施及方法传达给每位儿童家长；做好调查研究及科研工作，寻求更好的防控方法。

柯萨奇病毒作为一种单股正链小RNA病毒，其基因长度为7.4 kb，碱基对(G+C)的浓度大约为47%。两端为保守的非编码区，中间为编码区[7]。5′端以共价键结合1个小分子蛋白质Vpg(约7×103)，其作用与病毒RNA的合成和基因的组装配有关；3′端则带有polyA尾。编码区编码的病毒结构蛋白VP1～VP4与CoxV、EV71一样，VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面，具有中和抗原位点；VP4位于衣壳内部，病毒VP1一旦与受体结合后，VP4即被释出，衣壳松动，病毒基因组脱壳穿入[8]。5′非编码区没有多聚嘧啶区和多聚C区。柯萨奇病毒在气候变暖的季节里，容易污染环境，适合生存在湿、热的环境下并疯狂地传播；病毒比较耐热，失活温度在50 ℃以上，在4 ℃下可存活1年以上，而在-20 ℃下可长期保存，因此，在常规环境下可长期存活[9]。柯萨奇病毒存在核苷酸多态性或毒力位点的变异性。免疫功能不全的婴幼儿易感染，只要接触被病毒污染的外环境，就有可能被感染[10]。由于婴幼儿皮肤肤质较嫩，暴露部位较多，防护能力差，病原极易侵入机体而感染。

本研究结果显示，手足口病患者柯萨奇病毒核酸检测结果发现基因型EV71-RNA感染率较高，而CA16-RNA感染率较低，但从病情发展情况看，CA16-RNA感染的严重程度较高，很难进行救治，往往病情加重并发心肌炎而病死。另外，EV71-RNA咽拭子和肛拭子同时阳性的患者，其病情也较单一标本阳性者严重，更难医治，病死的危险率增高。由此可见，可疑手足口病患者，入院后及时进行柯萨奇病毒核酸检测，了解核酸的多态性和变异性，更有利于病患的救治。

综上所述，手足口病患者柯萨奇核酸检测在临床上具有重要的临床意义，对重症患者而言，病原学的诊断对判断预后和指导临床合理制订治疗方案有重要的参考价值，值得推广应用。

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Analysis on results of Coxsackie virus nucleic acid detection in HFMD patients*

WANGWu-qi1,SUGuo-sheng2△,WEIShan-qiu2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,YulinMunicipalHospitalofChineseMedicine,Yulin,Guangxi537000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,NanningMunicipalFourthPeople′sHospital/GuangxiAIDSClinicalTreatmentCenter,Nanning,Guangxi530023,China)

Objective To investigate the clinical application value of Coxsackie virus nucleic acid detection in the patients with hand-foot-mouth disease(HFMD).Methods The real-time fluorescent PCR technology was adopted,with a highly conserved region of EV71/CA16 genomic coding regionas the target area,the specific primers and fluorescent probes were set,EV71 RNA/CA16 RNA was detected by the one-step method of RT-PCR amplification.Results In 428 patients samples,136 cases were EV71-RNA positive,6 cases were CA16-RNA positive,including 1 case of EV71-RNA positive in throat swabs and anal swabs and CA16-RNA positive in throat swab.And there were 40 cases (80 specimens) of EV71-RNA positive in swabs and anal swabs,46 cases of single EV71-RNA positive in anal swab,10 cases of single EV71-RNA positive in throat swabs.In 6 cases of CA16-RNA positive specimens,4 cases were positive in anal swab,two cases were positive in throat swab.Conclusion The Coxsackie nucleic acid testing in HFMD patients has an important guiding significance for judging the severe patients and their prognosis and has an important reference value for guiding clinic to formulate the treatment plan.

foot and mouth disease; coxsackie virus; nucleic acid detection; gene

广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(Z2010483)。

王武琦，女，本科，主管技师，主要从事临床医学检验研究。

△通讯作者，E-mail：suguoshengv@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.016

A

1672-9455(2015)18-2688-02

2015-04-15

2015-05-25)