单核细胞增生李斯特菌的现代分子生物学分型检测方法及研究进展*

孔义华 综述，焦彦朝 审校

(1.贵阳医学院第二附属医院检验科，贵州凯里 556000;2.贵州出入境检验检疫局，贵阳 550004)



·综 述·

单核细胞增生李斯特菌的现代分子生物学分型检测方法及研究进展*

孔义华1综述，焦彦朝2审校

(1.贵阳医学院第二附属医院检验科，贵州凯里 556000;2.贵州出入境检验检疫局，贵阳 550004)

单核细胞增生李斯特菌； 脉冲场凝胶电泳； 基因芯片技术； DNA环介导恒温核酸扩增法； 基因测序技术

根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版将李斯特菌属(listeria)分为2个群7个种，单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes，简称LM)为其中1个菌种。LM为革兰阳性球杆菌，广泛存在于土壤和饲料中，健康人群、家养及野生动物都被认为是该菌的携带者。LM对营养要求不高，能在普通培养基上生长，在血平板上能形成狭窄透明的溶血环。并且LM对低温有较强的耐受性，因此长期放置在冰箱内的食物容易查出该菌。根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM可分为16个血清型，包括1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。主要以血清型1/2a、1/2b和4b对人致病，约占全球该病病例数的90%[1]。

LM是一种典型的能够寄生于巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和肝细胞胞内的寄生菌，一旦引起人畜共患传染病的发生，其病死率高达20%～70%[2]。美国食品药品管理局(FDA)规定即食食品中不得检出LM，而世界卫生组织将其列为20世纪90年代4大食源性致病菌之一。1997年3月和8月在我国云南省某县一自然村内先后两次暴发动物源性李斯特菌病，造成村内牲畜大量死亡，动物病死率约为100%，人群发病率分别为8.2%和8.6%[3]。近年来我国多次在美国、加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等进口肉类中检测出李斯特菌。据加拿大公共卫生署(PHAC)报道，加拿大每年约有100～140人感染LM，大约死亡30～50人。据美国食品药品管理局(FDA)报道，美国每年约有2 500人感染LM，其病死率高达20%～30%。人群主要通过食用被LM污染的食物而致病，目前LM已被广泛认为是导致食源性传染性疾病暴发流行和散发病例的重要致病菌。而细菌生物学分型、噬菌体分型和多位点酶电泳等传统的血清学分型鉴定方法均不能将所有从食品、患者和环境中分离的LM进行有效的分型检测，不能满足现代流行病学分子生物学调查研究的需要。因此，具有高分辨率、自动化、快速、稳定和重复性好等特点的现代分子生物学分型方法就更加受到国内外研究者的青睐，而相继出现的脉冲场凝胶电泳(PFGE)、基因芯片技术、DNA环介导恒温核酸扩增法及焦磷酸测序法则具有上述特点。本文现就针对LM的现代分子生物学分型检测方法及其研究进展进行综述。

1 PFGE

随着PFGE方法的不断改进和完善，该方法已经用于沙门菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等常见病原体的分子流行病学调查和分子分型研究。近年来LM的检测与分型也常采用PFGE。PFGE具有分辨率高、敏感性强、重复性好等特点，能区分其他方法不能鉴别的菌株(包括LM的4b型)，因此被认为是细菌分型的“金标准”[4]。在PFGE特定的电泳系统中，通过电场方向的不断交替变换及适宜的脉冲时间等条件，包埋于凝胶中的细菌DNA大片段能够得到很好的分离，形成清晰的图谱。不同的脉冲时间其分离的DNA片段大小不同，脉冲时间5～40 s，可以分离(50～600)×103的DNA片段。此外，电压、脉冲角度、电泳温度、缓冲液离子浓度等也是不容忽视的条件。在制作凝胶包埋细菌时，细菌浓度对于能否得到高质量、清晰的图谱也至关重要，需要对其进行严格的要求。为了能够在最短的时间内得到最好的电泳图谱，许多研究者都致力于建立快速的PFGE分型方法，改进该方法的各个环节。Briczinki等[5]研究报道，用快速PFGE法检测1 d即可得到与其他分型方法完全一致的结果，提示PFGE的改进可以提供一个方便、快速和准确的细菌分子生物学分型方法。这对以后的细菌分子分型和分子流行病学调查起到了积极的推动作用。

Howard等[6]在进行PFGE的过程中采用限制性核酸内切酶ApaⅠ、AscⅠ、NotⅠ和SmaⅠ对LM进行酶切，可以获得满意的大片段DNA分子。其中ApaⅠ的分辨力强于SmaⅠ，其酶切后产生的条带数目少于SmaⅠ，图谱清晰易读[7]。虽然ApaⅠ的分辨力也强于AscⅠ，但由于AscⅠ酶切后只产生8～14个DNA片段，较ApaⅠ酶切后产生的DNA片段数(18～23个)少，因此AscⅠ酶切后所得数据更易解释。病原菌分子分型实验室监测网络(PulseNet)推荐，在使用PFGE鉴别LM的过程中联合应用限制性内切酶可提高PFGE的分辨力。例如当分析流行病学相关的菌株是否为同一型别时，可联合使用ApaⅠ和AscⅠ酶将其区分(包括4b型)，且结果也易于观察和解释。PFGE已成为LM分型的最优方法之一[8]。目前国内外主要是采用限制性内切酶ApaⅠ或(和)AscⅠ对LM进行PFGE分型。在美国1998年与2002年先后发生的2次由LM引起的暴发流行事件中，PulseNet实验室正是采用PFGE分型方法成功地追踪到传染源[9]。

然而，该方法也存在一定的局限性。在细菌基因变异的情况下，由于PFGE只能提供有限的遗传信息，不能鉴别特点基因的存在和缺失。并且由于点突变、缺失或插入等单一基因事件的发生，PFGE在长期的流行病学研究中显得并不稳定。此外，限制性内切酶只能对大多数血清型的LM菌株进行酶切，虽然联合应用限制性内切酶可以提高检测的稳定性，但却导致实验时间的延长。这些问题都有待进一步的探讨和解决。

2 基因芯片技术

基因芯片技术是20世纪90年代初发展起来的一种全新微量分析技术，有着自动化、高通量、集成化等突出特点，其在微生物重要基因(如抗药基因、毒力基因、致病因子)的筛选监测和基于细菌基因组的流行病学研究中得到了广泛的研究，尤其是近年来基因芯片和液相芯片的研究。其原理：提取的生物标本DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后与提前点样于芯片表面的寡核苷酸杂交，最后通过检测杂交信号的强度和分布来确定检测样品中特定微生物的存在和丰度。Chizhikov等[10]采用寡核苷酸芯片研究了大肠杆菌、志贺菌、LM及沙门菌株的抗原决定簇和毒力因子与其致病性的关系，发现细菌毒力基因经多重PCR扩增后，结合基因芯片杂交筛选方法完全可以用于某些肠道致病菌的分析检测。Wilson等[11]研发出一套可同时检测18种致病菌(包括原核生物和真核生物)的多病原体识别微阵列，对炭疽杆菌的检测极限可达10 fg。LM、大肠杆菌0157和沙门菌等致病菌是危害食品安全的主要致病菌，研发出快速、准确、自动化的检测方法已成为确保食品安全的重要任务。

Volokhov等[12]以LM的6个毒力因子基因(hly、inlB、plcA、plcB、clp、iap)为靶基因建立了检测和鉴别LM的基因芯片技术，可简便、迅速地检测LM的6个基因型。Borucki等[13]采用585个探针建立了一个混合基因组芯片，通过对24株LM进行分析表明，该芯片对主要致病血清型可以作出良好的分析，所得聚类结果和系统进化分支结果一致；此外，还可鉴别同一血清型的不同菌株，并发现了一些可用于流行病学研究的遗传标记。胡瑞等[14]利用多指标同步分析(xMAP)液态芯片技术在4 h内成功地检测出了包括LM在内的4种引起食源性疾病的重要病原菌，其灵敏度可高达200 cfu/mL。尽管基因芯片技术在实际应用中还存在检测费用较高、实验室应用过程中的标准化及前期研发投入高昂等问题，但它已在病原菌的基因分型和菌种鉴定方面展示了非常广阔的应用前景[15]。

3 DNA环介导恒温核酸扩增法

DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)是一种连续、恒温、基于酶反应的，可用于细菌和病毒的定性检测的新型核酸扩增方法，具有高特异性和等温快速扩增的特点。其原理：针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在65 ℃左右恒温保存几十分钟，即可完成核酸扩增反应，且1 h内可扩增靶基因至1010倍。反应过程不会受到反应混合物的影响且受非靶序列DNA分子的影响较小。同时，在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，并且模板也不需要进行热变性，从而保证了LAMP扩增的高效特异性。LAMP具有操作快捷、简便、实验装置简单、费用低廉和可以通过肉眼判断目的基因扩增与否等优点。在李斯特菌属中保守且特有的是编码李斯特菌溶血素(LLO)的hly基因。马保华等[16]使用商业化的LAMP试剂盒在进口冻肉中检出7份LM阳性的样品，并与常规检验方法进行对比实验，表明采用LAMP技术检测LM的准确率可达100%。易海华等[17]采用LAMP与PCR方法同时检测LM的hly基因并进行对比，结果显示LAMP比PCR的灵敏度高100倍以上。但是该方法所需要设计的引物数量相对较多、结构复杂，尤其在病原体出现高度变异的时候难以进行。同时，在设计引物时还必须考虑靶序列的片段和茎环结构等因素。此外，该方法每次反应只能检测一个病原菌，其阳性反应也并不单是呈现单条带，容易出现拖尾和一些低分子质量的条带，且一旦产生非特异性扩增就不易鉴别。

4 焦磷酸测序技术

在细菌鉴定分型的分子生物学方法中，能够提供核酸碱基序列资料的分子诊断技术成为细菌鉴定分型的金标准。在利用Sanger法的DNA测序技术中，所测DNA长度可达1 000 bp。但是在实际工作中，如果引物选择恰当，只需要通过分析已知DNA序列片段中的几十对碱基即可满足细菌分型检测的需要[18]，而近几年发展起来的焦磷酸测序技术就能达到该要求。

焦磷酸测序技术是一种准确、快速、实时进行短片段DNA序列分析的方法，是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的技术。在DNA聚合酶、荧光素酶、腺三磷酸双磷酸酶和硫酸化酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度达到测定DNA序列的目的。新发展的焦磷酸测序技术无须对DNA片段进行荧光标记，也无须进行电泳，因此相应的仪器系统就不需要荧光分子的激发和检测装置[19]。李秀娟等[20]在用焦磷酸测序技术对LM的hly基因保守序列进行测序时发现第7个碱基的A与G置换，从而可以建立用焦磷酸测序技术对LM进行分子分型的方法。尽管用该方法进行分型有可能分型的种类较少，但是通过测序、分型一项实验就能完成，并且其结果可靠、稳定、操作简单，极大地减少了常规检测和分型的工作量。

5 展 望

由于LM分布广，适应能力强，对人类威胁较大，能使人致病的最小致病浓度尚不清楚，因此研发简单快速、灵敏高效、成本低、自动化程度高的检测技术显得非常重要。但是，目前还没有一种方法可以同时兼备以上优点。病原微生物的高通量检测技术是近年发展起来的前沿技术，在病原微生物的检测分型和预防控制领域具有十分重要的应用价值。由于其所需样品和剂量较少、快速省时、诊断结果精确、自动化操作程度较高，适宜用于食源性病原微生物的诊断与分型。PFGE、LAMP、基因芯片技术和焦磷酸测序技术等检测方法各有其优缺点，对这些技术在病毒、细菌的分型检测及传染病监控等方面的应用已经进行了大量研究。相信随着研究的不断进展和深入，这些高通量诊断分型技术和方法会不断完善，在食源性传染病病原体检测分型方面起到更加重要的作用。

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2014-07-26

2014-10-17)