2014版ICSH体液细胞自动计数仪性能和验证指南介绍

胡晓波，姚怡婷，王青，熊立凡

(1.上海交通大学医学院附属第三人民医院，上海201900; 2.上海交通大学医学院附属同仁医院，上海200050;3.上海市临床检验中心，上海200126; 4.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200001)

2014版ICSH体液细胞自动计数仪性能和验证指南介绍

胡晓波1，姚怡婷2，王青3，熊立凡4

(1.上海交通大学医学院附属第三人民医院，上海201900; 2.上海交通大学医学院附属同仁医院，上海200050;3.上海市临床检验中心，上海200126; 4.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200001)

编者按:实验室所面临的诸多难题之一是如何验证自动血液分析仪计数体液细胞的性能。与手工法相比，仪器法提高了计数的准确度、精密度和效率。在加拿大、美国、英国和日本的实验室展开了一项实践调查，以确定使用仪器计数体液细胞的实验室数量和仪器计数的性能指标。根据调查结果，国际血液学标准化委员会(ICSH)成立了体液细胞自动计数仪性能和验证国际工作组。为了提供自动体液细胞计数准确可靠的结果，工作组制定了一套有助于实验室规划和实施自动细胞计数仪验证的指南，经ICSH大会讨论并通过国际专家组审核后，进一步形成了共识。

介绍了2014年国际血液学标准化委员会(ICSH)关于体液细胞自动计数仪的性能评价指南。指南中就实验室对仪器的正确度、精密度、相关性、携带污染、检出限和分析测量范围等方面的性能验证提出了具体的方法和要求，尤其是明确规定了实验室对采用的各类体液标本均应做性能验证。

自动细胞计数;体液;脑脊液;验证

“2014版国际血液学标准化委员会(International Committee for Standardization in Hematology，ICSH)体液细胞自动计数仪性能和验证指南”的预期目的是建议自动细胞计数仪准确计数体液细胞的验证方法[1]。目前，市场上有多种类型仪器适用于体液细胞自动计数。因手工体液细胞计数需强劳力、重复性差，且需较高专业水平，许多实验室已采用自动计数方法，或开始验证其测量系统。虽然发表了很多验证的文章，但多数内容并不完整。少数文章研究了制造商未提供的细胞计数性能特征。因此，实验室有责任对仪器进行完整的确认，而不只是限于验证。为此，ICSH成立了体液细胞自动计数仪性能和验证国际工作组(简称工作组)。为了让自动体液细胞计数仪提供、准确、可靠的结果，工作组制定了一套有助于实验室计划和实施自动细胞计数仪验证的指南。

一、实验室体液检验现状

为了评价实验室体液检验的现状，由加拿大质量管理能力验证－实验室服务(Quality Management Proficiency－Laboratory Services，QMP－LS)机构制定调查问卷，分发到参加加拿大QMP－LS、美国病理学家学会(College of American Pathologists，CAP)、英国血液室间质量评价[United Kingdom that participate in the National External Quality Assessment Service for General Hematology，UKNEQAS(H)]的实验室以及参加日本实验血液学学会(Japanese Society of Laboratory Hematology，JSLH)性能验证计划的实验室。

调查问卷的目的是确定实验室是否使用自动仪器计数脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和其他体液的细胞以及如何确定这些仪器的性能特征。实验室需说明仪器的性能特征，以确定仪器是否符合体液细胞计数的质量要求。各国对仪器性能进行评估的实验室比例有很大差异，见图1。与精密度和正确性相比，对灵敏度、特异度和可报告范围进行评估的实验室较少。北美地区验证这些仪器性能的实验室比例高于英国和日本。

调查问卷中还询问了实验室采用何种程序来保证结果的质量。这些程序包括实验室是否做体液质控标本、检测标本前是否做背景计数以及对假性检测结果有无处理的程序。调查结果见图2。须注意的是，仅有少数实验室使用独立的体液细胞计数质控品。

市场上多数新型的血液分析仪具有体液检测模式，因此，实验室应验证制造商声称的每一类型体液的检测性能特征，包括CSF、浆膜液(心包腔、胸腔、腹腔)和滑膜液。由于低值细胞计数常见于各种体液，尤其是CSF，因此必须验证仪器准确计数低值细胞的性能。

二、自动系统的确认/验证

实验室应了解“确认”和“验证”之间的区别。“确认”通常由制造商实施，并提供仪器的性能特征。如制造商未对仪器进行确认，则必须由实验室进行确认。实验室进行确认时应遵循地区性有关实验室自建试验(laboratory－developed testing，LDT)的指南和建议。

验证是对制造商已确认的仪器进行证实，并提供置于指定检测地点的仪器能满足特定性能的证据。在仪器用于检测前，必须由使用实验室实施验证。用于检测临床标本的每台仪器均须进行验证或进行转移验证(见下述)。本指南的建议即用于验证制造商的声明。

(一)制造商预期用途

制造商须声明仪器的预期用途，表明已确认仪器的体液细胞计数的类型。每类体液细胞计数的分析测量范围(analytical measurement range，AMR)均由供应商提供。实验室的责任就是关注这些声明。若实验室要检测制造商声明中未包含的其他体液，则须确认仪器计数这些体液的性能。此试验即为LDT。表1列出的是最常用于体液计数的血液分析仪，包括了制造商确认的体液类型和参数。

(二)标本处理－分析前变异

实验室应注意标本采集过程的分析前变异，包括影响可报告结果的容器类型、标本运送和储存。每个实验室须有标准操作规程，此规程应遵循所在地区建议的指南。

(三)样品稳定性

很多文献报道标本采集后数小时内就会发生细胞退化、溶解和细菌生长。是否会发生这种情况取决于检测所用时间、贮存条件和标本类型。因此，应在标本稳定的时间内检测标本，而两种方法之间的相关性比较则应在2 h内完成。

(四)性能指标

提供仪器有能力报告可靠结果的证据是规范实验室的做法，在有些国家这已列入相关法规中。与外周血相比，体液有不同于全血的基质，所含细胞种类也不同。因此，确保实验室对准备分析的每种体液类型的结果具有真实性和可靠性很重要。外周血标本不能用于确认或验证。许多仪器有专用的体液模式，因此，对全血细胞计数(complete blood count，CBC)的验证不能满足体液细胞计数报告的要求。每个实验室应确定自己的体液细胞计数模式的可接受性。

如实验室有多台仪器，或是医疗大集团整体健康网络的一部分，可对其中一个地点的一台仪器进行完整验证，其他仪器则可进行转移验证;若仪器均来自同一制造商且型号相同，也只需对一台仪器进行完整验证，对其他仪器进行转移验证即可。但当其他地点开展实验室认可时，须提供可用的完整的验证数据。完整验证和转移验证应做的研究项目见表2。只要标本在运送过程中能保证完整性，就可在不同地点之间共享标本。

1.正确性正确性可用两种不同的方法进行验证。(1)可使用分割标本进行比对试验，通常至少有40例均匀覆盖可报告范围的患者标本，结果与实验室定义的限值进行比较，以判断差异有无统计学意义;若以手工计数为比较方法，则难度较大; (2)可使用定值的参考物质，如商品化质控品的预期回收值，实验室应设定可接受范围的限值。

2.精密度(可重复性)必须对仪器的精密度进行评价，其方式是尽可能的对所有可能影响仪器的变异因素进行评价。用于精密度评价的测试标本应与临床标本具有相同的特性。建议检测2个或多个浓度的标本，通常采用1个高浓度和1个低浓度，包括一个任意的医学决定水平的标本。建议所有标本应至少测定10次，以确定批内精密度。如测定10次有困难时应视可用的标本量而定，但为了能有效统计，至少应检测5次。还应测定一段时间的再现性(reproducibility)。因患者标本不稳定，故不可能在不同的日期测定同一标本，但可用体液质控品代替。

3.相关性相关性评价应按实验室可接受的程序和制造商建议的方法来处理和检测标本，可用实验室当前使用的、制造商声称的方法或参考方法进行研究。应注意的是，在大多数情况下，由制造商提供的用于确认的方法是基于手工计数法。建议至少检测40例标本，且应覆盖AMR，特别是医学决定水平。每一类型体液应做相关性确认。要确定AMR限值的偏倚，体液计数标本须有高值和低值，这对小型实验室来说可能有一定难度，但标本数越多，相关性越好，且对抗系列浓度干扰物的机会就越大。如参考方法是手工计数法，则建议对同一标本计数2次，以提高手工计数的精密度。应考虑标本的稳定性，为了避免标本储存成为可变因素，标本应在相同条件下储存，并在2 h内检测完毕。

4.携带污染要确保高浓度标本不会对随后检测的标本造成正偏倚，从而导致结果假性增高，这对CSF标本尤为重要。建议在检测体液标本前先做空白测试。要确保在分析体液标本前吸入非血液的液体不会引起体液标本的稀释，从而造成假阴性结果。应先检测高值标本，随后测定低值标本。高值标本应测定3次，记为A1、A2和A3，随后测定低值标本3次，记为B1、B2和B3。用下列公式计算携带污染:携带污染(%)=×100。有些实验室在分析体液标本前先检测空白标本，要确保此做法不会因预稀释而造成结果假性减低。如按实验室的可接受性标准，当携带污染不可接受时，应要求仪器进行维修或保养，然后再重复进行携带污染研究。

5.检测下限(lower limits of detection，LLD) LLD是最关键的验证步骤之一，尤其是CSF细胞计数。制造商须规定总有核细胞计数和红细胞计数的下限，且此下限不应低于制造商建议的限值。实验室计划分析的所有体液类型均应做LLD的验证，以证明标本的基质效应。验证时无须使用不同批号的试剂。了解各种低浓度的不同限值之间的关系很重要:(1)空白限(limit of blank，LOB):是多个空白标本经重复测量，所获得的空白标本最高测量值;(2)检出限(limit of detection， LOD)或分析灵敏度:是标本中能检出的分析物的最低测量值，一般通过重复检测至少4～6个低浓度细胞计数的标本而获得，标本浓度通常在LOB到4倍LOB范围内;(3)定量限(limit of quantitation，LOQ):是在可接受的精密度和正确度下，可检出的标本分析物最低测量值，须符合实验室对准确度或总允许误差的要求。各限值之间的关系是LOB＜LOD≤LOQ。LOD和LOQ常为相同的值，但必须高于LOB。那么如何验证制造商声明的LOB和LOD?(1)LOB的测定:如可能，应重复测定一种类型以上、不含任何细胞的体液。建议使用体液标本，以避免基质效应，如无法使用体液标本，则可用稀释液代替。每个标本应至少重复检测10次。考虑到实验室环境不同，此项研究至少应进行2～3 d。由于此类标本难以获取，所以可根据标本获取的时间来决定评估的天数。如制造商有特定的LOB，而重复测定的结果中最少有3次≤制造商LOB，则可接受制造商声明的LOB。(2)LOD的测定:如制造商有特定的LOD，则采用等同于制造商声称的低浓度标本和相同的程序;如95%的结果一致，则可使用制造商声称的LOD;否则，实验室须建立自己的LOD。(3)LOQ的测定:无论观察到的LOD精密度是否符合实验室设定的可接受精密度目标，均需做LOQ;可采用与检测LOD相同的方法测定LOQ。LOD或LOQ是能可靠检测的最低细胞计数值，故符合实验室不确定度即偏倚和不精密度的目标。

6.分析特异性(包括干扰因素)制造商应确定任何可能会导致结果错误的干扰物。体液中的干扰物可以是小凝块、结晶等任何物质，实验室应查出这些干扰物对结果的影响。研究应预先确定考虑实验室的特定患者群体，应涵盖各种体液类型，包括有干扰物的体液和来自各种疾病状态患者的体液。此项研究可纳入患者的相关性研究。

7.AMR和线性AMR是指细胞计数的范围，是仪器能准确测量未经任何预处理(如稀释)的标本的能力。应使用和体液基质相似的标本进行相关研究。建议实验室对仪器预期要检测的每一类型体液均做线性研究。制造商必须确定AMR，实验室有责任验证这些声明。线性可通过检测制造商声明的线性范围内的5～7个浓度予以证明，每个浓度应重复测定3次。试验中应使用制造商建议的稀释液。重要的是，线性验证浓度须包含医学决定值、最高浓度和检测下限值的细胞计数浓度，尤其是CSF标本。在验证期间可能很难收集到高浓度的标本。因此，可在日后收集到高值标本时再复做线性验证，并更新实验室方案，以反映更高的检测上限。

(五)标本数量限制

大多数实验室进行验证或确认研究时，面临的最大障碍可能是标本的可利用性。一旦决定做自动体液计数，就应将数据收集整合到每天的常规工作中。每次收到标本时，应采用两种方法检测，即当前方法和验证方法，并保存数据以供日后进行统计比较。累积的数据应定期进行审核，以确保各类体液都能得到验证。如两种方法的相关性较差，应在标本中查找各种常见原因。

对小型实验室而言，要收集到能满足验证研究所需的标本数量会很困难。但只有有足够的标本量才能做到有效统计，并确保仪器能提供真实的结果，特别是在医学决定值处。在QMP－LS的实际问卷调查中也涉及了验证标本用量问题。结果显示实验室使用的标本量各不相同，有的为1～10份，有的甚至＞80份。为了能有效统计，对每一种标本类型建议至少使用40份标本进行研究。

三、自动体液分析

用于自动计数的体液标本的处理过程不同于外周血标本。因此，体液标本自动计数的标准操作规程应包括标本处理、仪器模式更改和标本检测等所有步骤。

1.标本前处理制造商声明的预期用途必须表明标本检测前是否须做特殊处理，如滑膜液标本需用透明质酸酶进行预处理，以降低其黏度。

2.背景核查在检测任何标本、尤其是CSF标本前，应确保吸样通道清洁，以避免标本受污染。如在开盖模式下检测，对进样针外部进行清洁也是规范实验室的做法。背景计数必须≤空白值下限，否则应重做;如复做后背景计数仍很高，则需对仪器应进行清洗或维护。

3.处理假性结果的程序阳性检测结果必须进一步复核，否则不应当接受。当检测结果阳性时，大多数检测系统会报警。实验室操作程序应规定体液标本发生报警时应如何进行调查以及采取的措施。这些程序应包括如何检出造成假性结果的各种碎片或细胞团块以及表明是否有必要使用替代的计数方法。调查方法可以是外观检查或湿片显微镜检查。如实验室操作程序检测不可替代的标本(如CSF、关节腔积液等)，则报告中应有对异常情况(如肉眼可见的凝块、镜下细胞退变)和对结果准确性影响程度的描述。

4.结果超出报告范围的处理程序实验室必须确定每种体液的可报告上限和下限(见“AMR和线性”部分)。当检测结果超出实验室验证的AMR时，实验室应有处理超出可报告范围上限和下限标本的书面程序，包括结果超出AMR后实施稀释的程序。

5.测量单位QMP－LS的调查结果显示参与调查的实验室使用了不同的测定单位，这可能会造成临床医生的困惑。因此，实验室须表明用于报告体液细胞计数的单位，建议自动体液计数使用与全血细胞计数相同的测量单位，这样还可以消除可能导致错误结果的计算过程。在患者报告中也应明确标明所用测量单位。

四、质量控制

1.室内质量控制须对定量检测体液标本的分析系统进行质量控制。虽然有可用的商品化体液质控品，但也存在一些困惑，即有无必要做独立的质控或是否可接受日常使用的商品化CBC质控品。新型的血液分析仪均具有特定的体液检测模式。重要的是要了解此模式的检测通道、吸样路径、标本稀释、报告模式、计数体积或细胞分析是否与CBC模式不同。如体液标本采用不同于CBC计数的检测方法，就要有独立的质控品;也有用于检测仪器体液AMR下限的商品化质控品。其他还应考虑的是细胞分类计数是否由仪器报告。有些仪器报告两分类细胞，则商品化体液质控品也应包含此类成分。

2.能力验证能力验证是实验室认可的要求。对实验室而言，如无来自外部能力验证计划的标本，则须用其他方式来证明其检测能力，如采用盲样检测或实验室之间的标本交换检测及比对，以达到法规的要求。

综上所述，除仪器所分析的体液类型不同外，对体液细胞自动计数仪进行的确认/验证应与外周血细胞标本自动计数仪的确认/验证一样，其中最重要的是要确定体液细胞低值计数的正确性和精密度。验证/确认的目的就是确定仪器是否适合其预期用途，并识别任何潜在的误差。此误差可导致错误结果，有可能会影响患者的诊疗。

[1]BOUMER G，DE LA SALLE B，GEORGE T.et al.ICSH guidelines for the verification and performance of automated cell counters for body fluids[J].Int J Lab Hematol，2014，36(6):598－612.

Introduction of the ICSH guidelines for the verification and performance of automated cell counters for body fluids，2014 edition

HU Xiaobo1，YAO Yiting2，WANG Qing3，XIONG Lifan4.(1.No.3 People's Hospital Affiliated to Shanhai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 201900，China;2.St.Luke's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200050，China;3.Shanghai Centre for Clinical Laboratory，Shanghai 200126，China;4.Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200001，China)

This article introduces the 2014 edition of International Committee for Standardization in Hematology (ICSH)guidelines for the verification and performance of automated cell counters for body fluids.This guideline provides the particular methods and requirements for laboratories to verify the performance of automated cell counters in the aspects of accuracy，precision，patient correlation，carryover，limits of detection，analytical measurement range，etc.Meanwhile they specify that laboratories should execute the verification of their automated cell counters for different body fluids.

Automated cell counts;Body fliuds;Cerebrospinal fluid;Verification

1673－8640(2015)03－0209－05

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.001

2015－02－16)

(本文编辑:龚晓霖)

胡晓波，男，1969年生，硕士，主任技师，主要从事临床检验基础研究。