流感病毒疫苗开发的新挑战和解决方法

秦 伟，王文娟

(1.北京协和医院 中心实验室, 北京 100730； 2.武警北京市总队第三医院 整形美容科， 北京 100041)



短篇综述

流感病毒疫苗开发的新挑战和解决方法

秦 伟1*，王文娟2

(1.北京协和医院 中心实验室, 北京 100730； 2.武警北京市总队第三医院 整形美容科， 北京 100041)

目前已经获批的流感病毒疫苗的种类包括灭活病毒疫苗、减毒活病毒疫苗、重组HA疫苗等，并分析了其优缺点。面对新型流感病毒的出现和流感病毒的抗原漂移和逃逸，疫苗生产周期过长，接种老年人的免疫衰老现象，分析了未来的疫苗开发面临着的新的挑战，提出了解决问题的手段和未来流感疫苗研发的发展方向。

流感病毒；疫苗；血凝素蛋白；H1N1

1 流感概述

A型流感病毒属于正黏RNA病毒科，其可以感染禽类、猪、马以及人类；B型和C型则只可以感染人类和海豹。流感病毒基因共有8个片段(segment)，为单股负链RNA，可编码 14个病毒蛋白。病毒RNA位于病毒囊膜内，与核蛋白(NP)和3个病毒聚合酶亚单位(PA、PB1和PB2)相连，共同组成核糖核衣壳蛋白(ribonucleoprotein)复合物，负责 RNA 复制和转录。病毒粒子内还有基质蛋白M1，离子通道蛋白M2和病毒核传输蛋白(NEP)， 它们分别与病毒装配、出芽和 RNP从核内输出有关。病毒粒子的表面有2种糖基化蛋白，分别是血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)。在病毒粒子吸附到宿主细胞的过程中，HA蛋白可以吸附于细胞表面的唾液酸受体从而促进病毒感染细胞；NA蛋白则是在病毒复制完毕后从宿主细胞中释放过程中发挥作用，其可以促进病毒粒子从感染细胞释。A型流感病毒有多种亚型，其划分是根据它们表面糖蛋白的抗原性，共包括16种HA和9种NA[1- 2]。

A型流感和B型流感都会造成每年的流行， 在

成人中的感染率为5%～10%，而在儿童中达到了20%～30%。这造成了全世界每年(3～5)×106人数的感染和(2.5～5)×105人数的死亡。防控流感病毒最有效的措施就是接种疫苗。接种疫苗可以减轻流感病毒感染机体后的症状，尤其是在容易发生流感并发症的人群即儿童和老年人中接种。

2 季节性流感病毒疫苗

目前获批的流感病毒疫苗主要是针对于病毒HA蛋白的抗体，诱使机体产生不同毒株HA的抗体，能够减少相应的病毒滴度并且阻止病毒感染[3]。季节性流感疫苗需要每年重新评估并且合成，来保持对已发生的抗原漂移流行病毒的特异性。由于病毒的RNA依赖型的RNA聚合酶的易错率(error-prone)很高，并且缺少容错机制，从而导致HA蛋白和其他病毒蛋白的基因突变，此过程称为抗原漂移(antigenic drift)。此外，在已经存在的抗体的正向选择下，HA蛋白也会进行抗原逃逸(antigenic escape)。因此，每年新疫苗的设计都需要提前在新的季节性流感爆发前7～8个月开始，来满足疫苗生产的周期[4]。

目前获批的季节性流感疫苗共分为3种，分别是灭活(inactivated)病毒疫苗、减毒活(live attenuated)病毒疫苗和重组HA疫苗[5]。这些疫苗一般都是多价的(multivalent)，其多价组分中含有计算机预测的下个季节有可能爆发的A型流感和B型流感的HA蛋白组分。

2.1 灭活病毒疫苗

灭活病毒疫苗(inactivated influenza vaccine，IIV)通常是一个分离的病毒粒子或亚单位疫苗(subunit vaccine)，再经理化方法(如甲醛或β-丙内酯)处理后，使其该病毒粒子丧失感染力或者毒性，但仍保有其免疫原性的一类生物制剂[5]。三价灭活疫苗(trivalent inactivated vaccine，TIV)包括A型流感的H1N1和H3N2亚型加上一个主要的B型流感病毒亚型。最近获批的四价流感疫苗(quadrivalent inactivated vaccine，QIV)包括了2株B型流感病毒和A型流感病毒的H1N1和H3N2亚型。IIV可以引起毒株特异性的血清IgG抗体反应，并且可用于6个月或年龄更大的个体。

2.2 减毒活疫苗

第二种疫苗是减毒活疫苗(live attenuated influenza vaccine，LAIV)。这种疫苗与灭活疫苗最大的不同是其具有在宿主上呼吸道小范围的复制力，而后者无法复制。因此，同灭活疫苗相比，减毒活疫苗的免疫性与自然感染下获得的免疫更加相近，能够持续的产生免疫力。这种疫苗通常是4种与QIV包含的流感亚型相同的流感病毒混合物，且其接种方式为鼻腔喷雾法。LAIV是一种温度敏感性的(temperature-sensitive)减毒性突变(attenuating mutations)的活病毒疫苗。这些突变的目的就在于使该病毒疫苗在温度较高的下呼吸道有限复制，而在温度较低的鼻腔能够正常复制[6]。接种LAIV不但可以激活毒株特异性的血清IgG反应，还可以增强黏膜IgA的产生和T细胞反应。LAIV对于一些抗原漂移的流感病毒免疫效果也很高。其接种人群为2～49岁的人群。

2.3 重组HA疫苗

第三种获批的流感疫苗即为FluBlok，在2013- 01- 06美国食品和药品监督管理局(FDA)宣布已批准Flublok，它是用一种昆虫病毒(杆状病毒baculovirus)表达系统和重组DNA技术制造的三价流感疫苗。Flublok被批准为18～49岁人们预防季节性流感[5]。FluBlok的生产周期非常短，因此这种疫苗的研发在流感大爆发时尤为珍贵。

这3种季节性流感疫苗安全性较高。灭活疫苗最常见的不良反应报告即为接种部位的疼痛、泛红和肿胀；减毒活疫苗则为流涕和鼻塞，一些特殊人群出现发热和咽喉痛。

3 流感疫苗优化过程中的难题

尽管目前的流感疫苗对于健康的成年人群免疫效果显著，但是仍然存在着一些不足及问题。包括疫苗无法快速大量生产、新型流感病毒的出现及如何提高老年人接种疫苗的免疫原性等。目前有一些方法来克服和解决这些不足和问题，并且提高免疫原性和流感疫苗的功效。

3.1 短期无法大量生产

甲型H1N1造成的2009年流感大流行反映了在短时间内疫苗生产和运输的难度。面对2009年H1N1的第二轮流行时，针对H1N1的IIV还完全没有准备完毕[7]。导致这一情况的原因便是IIV和LAIV都需要用鸡胚进行繁毒复制，一次流感大流行就会使鸡胚无法供应[8]。在未来应对这一窘况的方法之一就是库存大量的不同亚型的流感疫苗以备不时之需，这一方法还需要选择不同亚型流感的代表性毒株来进行疫苗化，以及对这些疫苗分别进行临床前和临床研究；就是研发不需要鸡胚繁殖的流感疫苗。Flucelvax是一种新的获批疫苗，其可以在哺乳动物的细胞系当中进行复制扩增；FluBlok是在昆虫细胞中表达生产的，因此也不依赖鸡胚；此外，DNA疫苗和病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)疫苗同样也不需要鸡胚进行繁殖，但目前仍在临床研发中。

3.2 新型病毒的产生

20世纪共爆发了4次流感大流行。分别在1918年、1957年、1968年以及最近的2009年[9]。新型流感会导致疫苗的失效。一旦流感病毒具备了感染人类甚至人间传播的能力，就会造成流感的大爆发[10]。IIV和LAIV都被设计为针对流行流感病毒疫苗以用于新型流感亚型的出现。但是，IIV疫苗的免疫原性很低，需要大量的抗原剂量；LAIV在一期临床实验中，其免疫原性通常是不稳定的[11- 12]。由于无法精确的预测引发下次大流行的流感毒株，期望能够得到一种针对某个流感病毒蛋白且能够产生广谱的交叉反应的‘通用疫苗’(universal vaccine)，且不需要每年接种疫苗[13]。目前两个目标蛋白为HA和M2蛋白[14]。HA的功能不再累述。M2是流感病毒的离子通道蛋白，对于流感病毒在宿主细胞中的释放过程密切相关。针对M2的抗体无法中和病毒的感染，但能够通过抗体依赖性细胞调控细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)来清除被感染细胞[7, 15]。

流感病毒会发生抗原漂移和突变，同时，接种疫苗后产生的抗体会随着时间而浓度下降。因此，就需要每年接种疫苗来持续进行免疫保护。目前一些方法可以用来增加流感疫苗的交叉反应性。包括：使用计算机设计好的HA序列、研发针对流感病毒中能够引发T细胞免疫的病毒蛋白疫苗、加入佐剂等方法。

计算机优化的广谱反应抗原(computationally optimized broadly reactive antigen)即COBRA HA[16- 17]，COBRA HA装配在VLP疫苗上。COBRA HA为同一亚型的流感病毒不同HA蛋白的共有序列，保留这些保守序列生产的疫苗就会产生交叉性反应。H5N1 COBRA疫苗被证明具有良好的交叉反应，能够针对不同毒株的H5N1病毒进行免疫，使之致病性下降[18]。

另外一个提高流感疫苗交叉免疫反应的方法就是针对流感病毒引发的T细胞免疫。流感病毒引发的T细胞免疫反应一般是由内部保守的NP和M1造成的。利用病毒载体(viral vectors)进行疫苗的构建。病毒载体是能够持续高表达目标蛋白的有限复制的病毒，其本身即可为佐剂来增加免疫反应，也可针对于各种不同的细胞，并在发病的不同时期进行接种[19]。例如：病毒载体疫苗Ankara(Modified Vaccinia Virus Ankara，MVA)，其能够表达流感病毒的NP和M1；在一期和二期临床实验中，MVA-HA-H5N1疫苗能够使成年人产生免疫反应，并且在一年后仍能够产生大量的抗体[20- 21]。T细胞免疫的无法阻止病毒的入侵，但能够降低感染的严重程度和持续时间[7]。如在2009流感大流行中，T细胞免疫的强度被发现同个体的发病程度呈负相关。此外，在目前获批的疫苗当中，LAIV产生的T细胞免疫反应要强于IIV。

3.3 老年人的免疫衰老

感染流感的老年人会比成年人产生更多的并发症，且对于新型流感的免疫力比成年人更低[22]。因此，一般疫苗对于这类群体的免疫效果非常有限。有两种方法能够使老年人通过IIV产生足够的抗体：一是增加接种疫苗的剂量[23]，如前所述的病毒载体MVA-NP+M1，其在一期临床实验中，MVA-NP+M1疫苗能够使50～85岁的健康老年人产生免疫反应[24]；二是使用佐剂来增加IIV在老年人身上的免疫原性[5]。佐剂的使用也可以诱发加强疫苗使用过程中的免疫反应，例如一些“水包油”的佐剂，如固醇角鲨烯类的AS03和MF59[7]能够激活细胞产生大量的细胞因子和趋化因子，从而招募免疫细胞到感染部位。

4 总结与展望

TIV和LAIV在健康成年人和儿童中已经分别达到了60%和83%的免疫率[25- 26]。然而，这些疫苗在面对新的流感病毒流行时，作用十分有限，并且对老年人的免疫效果也非常低下。流感疫苗应能够保护所有年龄段的人群，特别是易感人群。理想的新型疫苗应能够增强免疫反应的幅度，其生产和复制不依赖于鸡胚，在短期内可大量生产，可适用于所有的流感病毒亚型，并不需要每年接种。期望不久之后新型流感疫苗能够克服目前疫苗的缺点，更好地对抗潜在的高致病性流感病毒。

[1] Tong S，Li Y，Rivailler P，etal. A distinct lineage of influenza A virus from bats [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109:4269- 4274.

[2] Tong S，Zhu X，Li Y，etal. New world bats harbor diverse influenza A viruses [J]. PLoS Pathog，2013，9:e1003657.

[3] 蔡孟华, 李铮, 董鹏，等. 高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白中和抗体及表位的鉴定 [J]. 基础医学与临床，2014，34：633- 637.

[4] William KA, Eduardo AB, Uzma B,etal. WHO report: strengthening the influenza vaccine virus selection and development process:report of the 3rd WHO informal consultation for improving influenza vaccine virus selection held at WHO headquarters, geneva, switzerland, 1-3 April 2014[J]. Vaccine, 2015,33:4368- 4382.

[5] Grohskopf LA，Olsen SJ，Sokolow LZ，etal. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP)—United States, 2014- 15 influenza season [J]. MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2014，63:691- 697.

[6] Coelingh KL，Luke CJ，Jin H，etal. Development of live attenuated influenza vaccines against pandemic influenza strains [J]. Expert Rev Vaccines，2014，13:855- 871.

[7] Lee YT，Kim KH，Ko EJ,etal. New vaccines against influenza virus [J]. Clin Exp Vaccine Res，2014，3:12- 28.

[8] Hannoun C. The evolving history of influenza viruses and influenza vaccines [J]. Expert Rev Vaccines，2013，12:1085- 1094.

[9] Taubenberger JK，Kash JC. Influenza virus evolution, host adaptation, and pandemic formation [J]. Cell Host Microbe，2010，7:440- 451.

[10] Babu TM，Levine M，Fitzgerald T，etal. Live attenuated H7N7 influenza vaccine primes for a vigorous antibody response to inactivated H7N7 influenza vaccine [J]. Vaccine，2014，32:6798- 6804.

[11] Baz M，Luke CJ，Cheng X，etal. H5N1 vaccines in humans [J]. Virus Res，2013，178:78- 98.

[12] Jin H，Subbarao K. Live attenuated influenza vaccine [J]. Curr Top Microbiol Immunol，2015，386:181- 204.

[13] Subbarao K，Matsuoka Y. The prospects and challenges of universal vaccines for influenza [J]. Trends Microbiol，2013，21:350- 358.

[14] Krammer F，Palese P. Influenza virus hemagglutinin stalk-based antibodies and vaccines [J]. Curr Opin Immunol，2013，3:521- 530.

[15] Li CK，Rappuoli R，Xu XN. Correlates of protection against influenza infection in humans—on the path to a universal vaccine? [J]. Curr Opin Immunol，2013，25:470- 476.

[16] Giles BM，Ross TM. Computationally optimized antigens to overcome influenza viral diversity [J]. Expert Rev Vaccines，2012，11:267- 269.

[17] Giles BM，Ross TM. A computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) based H5N1 VLP vaccine elicits broadly reactive antibodies in mice and ferrets [J]. Vaccine，2011，29:3043- 3054.

[18] Giles BM，Crevar CJ，Carter DM，etal. A computationally optimized hemagglutinin virus-like particle vaccine elicits broadly reactive antibodies that protect nonhuman primates from H5N1 infection [J]. J Infect Dis，2012，205:1562- 1570.

[19] Tripp RA，Tompkins SM. Virus-vectored influenza virus vaccines [J]. Viruses，2014，6:3055- 3079.

[20] Kreijtz JH，Goeijenbier M，Moesker FM，etal. Safety and immunogenicity of a modified-vaccinia-virus-Ankara-based influenza A H5N1 vaccine: a randomised, double-blind phase 1/2a clinical trial [J]. Lancet Infect Dis，2014， 14:1196- 1207.

[21] Talaat KR，Luke CJ，Khurana S，etal. A live attenuated influenza A(H5N1) vaccine induces long-term immunity in the absence of a primary antibody response [J]. J Infect Dis, 2014, 209：1860- 1869.

[22] 薛惠文，章静波. 数年或数十年后,暴露于流感病毒仍能激发免疫反应 [J]. 基础医学与临床，2013，33：1409.

[23] Haq K，McElhaney JE. Immunosenescence: Influenza vaccination and the elderly [J]. Curr Opin Immunol，2014，29:38- 42.

[24] Antrobus RD，Berthoud TK，Mullarkey CE，etal. Coadministration of seasonal influenza vaccine and MVA-NP+M1 simultaneously achieves potent humoral and cell-mediated responses [J]. Mol Ther，2014，22:233- 238.

[25] Ohmit SE，Petrie JG，Malosh RE，etal. Influenza vaccine effectiveness in the community and the household [J]. Clin Infect Dis，2013，56:1363- 1369.

[26] Osterholm MT，Kelley NS. Sommer A,etal. Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis [J]. Lancet Infect Dis， 2012，12:36- 44.

新闻点击

孕妇饮食习惯对胎儿健康影响深远

据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2014- 05- 07报道，最新研究显示，女性在受孕前后的饮食习惯，将影响胎儿终身的DNA。另一研究认为，怀孕妇女的饮食习惯也将遗传给胎儿且影响下一代健康。

根据发表在《自然通讯》(NatureCommunications)上的一项研究，首次以人类为研究对象，在非洲冈比亚的农村展开。冈比亚当地的饮食会随着季节不同而有所区别，于是研究单位选取了84名妇女，分别检验雨季与干燥季节受孕女性的血液。等她们产后2～8个月，再检验婴儿体内的DNA。

该研究的首席科学家涵宁(Branwen Henning)说：“这项研究说明，女性在受孕前与怀孕期间的平衡饮食，将对下一代的健康有着重要影响。”研究单位认为，最终的目标是为那些即将成为母亲的女性定义一个合理的膳食标准，可望避免DNA在甲基化过程中产生的缺陷。

每周走路150 min显著减少老年人身体残疾风险

据英国《BBC新闻》(BBC NEWS)2014- 05- 30报道，最近，美国国家卫生研究院一项大型临床试验证实，每周只要散步150 min，就能减少老年人身体残疾的风险。步行如果能坚持下去，还可以代替很多保健品，并提高老年人晚年生活质量。

美国国家卫生研究院团队以70至89岁的老年人进行实验，这些老年人平常习惯久坐不动，但实验开始时他们还能行走400米，医生评估未来有失去活动能力的风险。为了比较走路对健康的影响，研究人员招募了1 635名老人，并将他们随机分为体力活动组和健康教育组，作为为期两年半的跟踪研究。

其中体力活动组818人，每周要走路150 min，还要按时参与重量、灵活性与平衡能力的训练；健康教育组817人，除参加营养、卫生保健等健康方面的课程，每个月还要完成5～10 min的上身伸展训练。

结果发现，体力活动组与健康教育组分别有246人和290人失去活动能力，即无法行走400 m。研究显示，体力活动组失去活动能力的风险比健康教育组低18%，成为永久性行动不便的概率也降低了28%。

美国国家卫生研究院医学博士理霍兹(Richard J·Hodes)说，这项研究表明：适度的有氧、抗阻及灵活性运动确实有益于老年人健康，可减少他们失去活动能力的风险。该研究报告在线发表于2014- 05- 27《美国医学协会杂志》上。

New challenges and solutions of influenza vaccine

QIN Wei1*, WANG Wen-juan2

(1.Central Laboratory, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730; 2.Dept. of Plastic Surgery, 3rd Hospital of Beijing General Hospital of CPAPF, Beijing 100041, China)

Vaccination can reduce illness and severity of infection. This review focuses on how currently licensed influenza vaccines are developed, such as inactivated influenza vaccine, live attenuated influenza vaccine, and recombinated HA vaccine, and to explain the weakness of new influenza virus poses vaccine including long production cycles, and emerge of novel influenza virus and immunosenescence in the elderly. Vaccine approaches to these challenges are discussed.

influenza; vaccines; hemagglutinin; H1N1

2015- 08- 17

2015- 10- 23

1001-6325(2015)12-1700-05

Q939

A

*通信作者(corresponding author)：xieheqinwei@163.com