BBG染色兔眼内界膜效果分析

王 虎，袁建枚，全婵娟，杨新怀

(中山市小榄人民医院眼科，广东 中山 528415)

BBG染色兔眼内界膜效果分析

王 虎，袁建枚，全婵娟，杨新怀

(中山市小榄人民医院眼科，广东 中山 528415)

目的 探讨不同染色时间及不同染色剂浓度的亮蓝G(Brilliant blue G，BBG)对内界膜染色的效果差异。方法用12只新西兰白兔按照随机化原则分为四组，行常规23G玻璃体切割术，气液交换后1组给予0.125 mg/ml BBG染色15 s，2组给予0.125 mg/ml BBG染色120 s，3组给予0.25 mg/ml BBG染色15 s，4组给予0.25 mg/ml BBG染色120 s，染色后BSS冲洗干净，手术显微镜下观察染色效果。结果1组完全染色1眼，不完全染色1眼，未见染色4眼；2组完全染色5眼，不完全染色1眼；3组完全染色1眼，不完全染色3眼，未见染色2眼；4组完全染色5眼，不完全染色1眼。染色结果四组间差异均具有显著统计学意义(P=0.008)，根据平均秩次推断第2组与第4组染色效果好于第3组，第1组染色效果最差。结论BBG染色兔眼内界膜效果与染色时间相关，时间越长，染色效果越好，与染色剂浓度相关性不高。

BBG；内界膜；兔

Brilliant blue G(以下简称BBG)因其特殊的染色效果，很早就应用于各种蛋白质的染色。Enaida等[1]在其实验研究中指出，BBG具有良好的染色特性，实验条件下，它可以在0.25 mg/ml的浓度下10～15 s染色内界膜，因此它对于玻璃体视网膜手术可能是一种理想的染色材料[2]。

1 材料与方法

1.1 材料 将BBG(德国Fluoron GmbH)以孔径0.2 μm的滤器过滤，一半为0.25 mg/ml的BBG溶液，另一半加以眼内灌注液(BSS Alcon Lab)1:1配制成0.125 mg/ml BBG溶液。

1.2 实验动物及分组 健康成年新西兰白兔12只(广东省实验动物中心提供)，体重1.8～2.2kg，雌雄不限，排除眼部疾患者。随机分为四组，每组3只。

1.3 实验方法

1.3.1 制作动物模型 复方托品酰胺扩瞳，苯巴比妥8 mg/kg和氯丙嗪12.5 mg/kg腹腔注射麻醉动物，辅以爱尔凯因滴眼液表面麻醉。行23G标准玻璃体切除术，切除中轴部位玻璃体后，波切头吸引人工造成玻璃体后脱离，然后将残余玻璃体切除干净，气液交换将玻璃体腔内灌注液置换干净，分别于兔眼黄斑处滴染色剂，范围黄斑周围越2PD，每组染色相应时间后，玻璃体腔重新灌入眼内灌注液，置换染色剂干净后，手术显微镜最大放大倍率下观察染色效果。

1.3.2 染色效果 根据术中染色范围内，内界膜染色的情况，将染色效果分为完全染色(均一淡蓝色)，部分染色(斑驳样着色)，未见染色(无明显可见着色)。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件进行数据统计分析。各组染色效果的比较采用Kruskal-WallisH检验，组间效果通过秩次(Mean Rank)推断，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 染色效果 1组6眼完全染色1眼，不完全染色1眼，未见染色4眼；2组完全染色5眼，不完全染色1眼；3组6眼完全染色1眼，不完全染色3眼，未见染色2眼；4组完全染色5眼，不完全染色1眼。染色结果四组间差异具有统计学意义(χ2=11.784，ν=3，P= 0.008)，根据平均秩次推断第2组和第4组染色效果好于第3组，第1组染色效果最差，见表1、图1。

图1 染色情况

表1 各组染色效果分析（眼）

2.2 真菌性眼内炎 结果显示所有实验眼均未发生眼内炎。

3 讨 论

黄斑裂孔(Macular hole)是严重影响视力的眼科疾病之一，早在1880年即为人们所认识[3]，但一直缺乏有效的治疗手段，直到Gass发现黄斑中央凹前的玻璃体切线方向牵拉是特发性黄斑裂孔形成的主要原因，并将黄斑裂孔分为4期[4]。在黄斑裂孔四个期的自然病程中，玻璃体后界膜、视网膜前膜、内界膜都是切线牵拉力的来源，OCT的出现为此理论提供了有力的论据。因此，黄斑裂孔手术最关键的不是想办法粘合裂孔，而是从根本上解除切线方向的牵拉。Lam等[5]的实验研究表明，黄斑裂孔性视网膜脱离患者中，行内界膜剥离组的黄斑裂孔闭合率较未行剥离组高，两组比较差异有统计学意义(P=0.013)。

但是，内界膜(Internal limiting membrane，ILM)作为视网膜最内层，是一层厚度仅约1 μm的无色透明膜，它由Muller细胞的基底膜、少量胶质细胞及玻璃体纤维共同组成，手术中难于辨认，难以剥除，强行剥除往往会导致视网膜损伤甚至穿孔。Shimada等[6]的研究表明术中直接剥除内界膜，即使是最有经验的玻璃体视网膜疾病医师，70%左右会有内界膜的残留。

为了解决内界膜透明、无法直视的状态，研究者们先后应用台盼蓝(Typan blue，TB)、吲哚青绿(Indocyaninegreen，ICG)、溴酚蓝(Bromphenol blue，BPB)、曲安奈德(Triamcinolone acctonide，TA)进行内界膜染色，但是却因为对视网膜、视神经的毒性，或染色效果不佳而逐渐少应用于临床[7]。

亮蓝，分子式为C47H48N3O7S2Na，颜色指数为42 655，分子量为854，最早应用于蛋白质的染色。它的染色特性使它能够在低浓度的状态下快速染色蛋白质，而Rodrigues等[8]的研究表明，染色剂的浓度和染色时间是影响其视网膜毒性的两大因素。

国外大量研究均应用0.25 mg/ml BBG染色ILM 120 s，作为常规的染色浓度与染色时间，先前实验结果也表明这是染色达到较好效果的最佳的染色浓度与时间。但是我们的研究表明，0.125 mg/ml BBG染色ILM 120 s，可以达到同样的染色效果，两组的染色效果差异无统计学意义；但是染色浓度的下降，会进一步降低染色剂对视网膜功能的损害。实验研究表明，高浓度的BBG可以导致视网膜内核层细胞结构改变，但未发现细胞凋亡，ERG无明显下降[9]。

由于国外有应用BBG染色后诱发真菌性眼内炎的报道，本研究在抽取染色剂时，应用孔径0.2 μm的滤器过滤，全部实验眼未见眼内炎改变，而其对染色效果并无明显影响。

Totan等[10]的研究表明，在气泡下注入相同浓度的染色剂，相同的时间下，内界膜染色效果差异有统计学意义。因此在我们的实验中，采用气液交换后再染色的方法，降低了玻璃体腔液体对染色剂的稀释作用，从而得到更准确的结果。

本实验通过不同浓度的BBG对内界膜染色不同时间，得出染色效果与染色时间与染色剂浓度相关性不高的结论。染色时间越长，染色效果越好。在接下来的实验中，笔者将进一步对BBG对视网膜结构及功能的影响进行研究。

[1]Enaida H,Hisatomi T,Goto Y,et al.Preclinical investigation of internal limiting membrane staining and peeling using intravitreal brilliant blue G[J].Retina,2006,26:623-630.

[2]Enaida H,Hisatomi T,Hata Y,et al.Brilliant blue G selectively stains the internal limiting membrane:brilliant blue G-assisted membrane peeling[J].Retina,2006,26:631-636.

[3]Sjaarda RN.Macular hole[J].Chin Ophthalmol Nor Am,1995,35 (4):105-122.

[4]Gass JD.Idiopathic senile macuar hole:its early stages and pathogenesis[J].Arch Ophthalmol,1988,106(5):629-639.

[5]Lam RF,Lai WW,Cheung BT,et al.Pars plana vitrectomy and perfluoropropane(C3F8)tamponade for retinal detachment due to myopic macular hole:a prognostic factor analysis[J].Am J Ophthalmol,2006,142(6):938-944.

[6]Shimada H,Nakashizuka H,Hattori T,et al.Double staining with brilliant blue G and double peeling for epiretinal membranes[J]. Ophthalmology,2009,116(7):1370-1376.

[7]Schumann RG,Gandorfer A,Priglinger SG,et al.Vital dyes for macular surgery:a comparative electron microscopy study of the internal limiting membrane[J].Retina,2009,29(5):669-676.

[8]Rodrigues EB,Meyer CH,Mennel S,et al.Mechanisms of intravitreal toxicity of indocyanine green dye:implications for chromovitrectomy[J].Retina,2007,27(7):958-970.

[9]Lüke M,Januschowski K,Beutel J,et al.Electrophysiological effects of brilliant b lue G in the modle of the isolated perfused vertebrate retina[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2008,246(6): 817-822.

[10]Totan Y,Güler E,Gürağaç FB,et al.Brilliant blue G assisted macular surgery:the effect of air infusion on contrast recognisability in internal limiting membrane peeling[J].Br J Ophthalmol,2015,99 (1):75-80.

Dyeing effect of brilliant blue G on internal limiting membrane in rabbits.

WANG Hu,YUAN Jian-mei,QUAN Chan-juan,YANG Xin-huai.Department of Ophthalmology,Xiaolan People's Hospital of Zhongshan,Zhongshan 528415,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo analyze the dyeing effect of brilliant blue G(BBG)on internal limiting membrane (ILM)at different time and different concentration.MethodsConventional 23-G pars plana vitrectomy was performed in the eyes of 12 New Zealand white rabbits and the experiment eyes were randomized into four groups.After Gas-fluid exchanged,four groups were given different concentrations of BBG solution to dye the ILM for different time:group 1(0.125 mg/ml BBG for 15 s);group 2(0.125 mg/ml BBG for 120 s);group 3(0.125 mg/ml BBG for 15 s); group 4(0.125 mg/ml BBG for 120 s).Then BBG was cleaned up by BSS.The results were observed by the operation microscope.ResultsGroup 1:complete dyeing 1 eye;incomplete dyeing 1 eye;not dyeing 4 eyes.Group 2:complete dyeing 5 eyes;incomplete dyeing 1 eye;not dyeing 0 eyes.Group 3:complete dyeing 1 eye;incomplete dyeing 3 eyes;not dyeing 2 eyes.Group 4:complete dyeing 5 eyes;incomplete dyeing 1 eye;not dyeing 0 eyes. The dyeing effect of four groups had statistically significant differences(P=0.008).Based on the average rank inference,the second and the forth group were better than the third group,and dyeing effect of the first group was the worst.ConclusionThe dye effect is correlated with the dyeing time and the concentration is not as important as it.

Brilliant blue G(BBG);Internal limiting membrane(ILM);Rabbits

R-332

A

1003—6350（2015）04—0478—03

2014-09-11)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.04.0175

广东省医学科学技术研究基金（编号：A829）

王 虎。E-mail：wh20005@163.com