王亚麒,陈丹梅,袁玲
(西南大学资源环境学院,重庆 400716)
黄连须根浸提液对莴苣、绿豆和白菜的化感效应
王亚麒,陈丹梅,袁玲*
(西南大学资源环境学院,重庆 400716)
试验以莴苣、绿豆和白菜为材料,研究了黄连须根浸提液(extracts from fibrous roots ofCoptischinensis, ERC)对种子萌发和幼苗生长的化感效应,目的是减轻化感危害,提高土地持续生产力。结果表明,低浓度(200 mg/L)的ERC处理种子后,3种供试作物种子发芽率、发芽指数无显著变化,但种子的活力指数降低,幼苗的生物量和根系活力显著下降;随着浓度加大(>400 mg/L),抑制种子中的淀粉和蛋白质水解,降低游离氨基酸、可溶性糖和可溶性磷的含量,影响种子萌发;ERC浓度达到800 mg/L时,根尖向上卷曲而离开ERC溶液,根毛消失,根系畸形且颜色变褐,叶片硝酸还原酶和叶绿素合成减少,抑制幼苗生长。ERC对莴苣种子发芽和幼苗生长抑制作用大于绿豆和白菜。因此,在集约化种植黄连的土壤中,可能造成莴苣、绿豆和白菜等后季作物减产。
黄连;浸提液;蔬菜;化感效应
黄连(Coptischinensis,毛茛科黄连属)为多年生草本植物,具有清热解毒和燥湿泻火的功效,用途广泛,是我国人工栽培的10种大宗中药材植物之一[1],具有抗真菌、细菌、某些肿瘤细胞和寄生虫等药理作用[2]。野生黄连生长于海拔1000~1900 m凉湿荫蔽的山间密林中,数量稀少,目前以人工集约化栽培为主。在它们的生长过程中,通过茎叶淋溶,根系分泌和残株腐解等多种途径向土壤生态系统释放以季胺类生物碱为主的多种化感物质。其中,黄连根系的小檗碱(又称黄连素,berberine)含量最高,为5%~8%, 其次为黄连碱(coptisine)、甲基黄连碱(worenine)、掌叶防己碱(palmatine)、药根碱(jatrorrhizine)、非洲防己碱(columbamine)、黄柏酮(obakunone)、黄柏内酯(obakulactone)、木兰花碱(magnoflorine)和阿魏酸(ferulic acid)等。在黄连根系分泌物中,以小檗碱的分泌量最高,可达总分泌物的50%以上[3-4]。此外,黄连叶片也含有小檗碱(1.4%~2.8%)、黄连碱、掌叶防己碱和药根碱等[5],经落叶和收获残留等形式进入土壤。值得注意的是,黄连生长周期长达5~7年,种植过黄连的土壤多数长期休闲空置不能种植其他植物,黄连根茎或须根浸提液严重抑制幼苗的生长[6]。已有的研究表明,植物释放的化感物质对周围其他植物产生有利或有害作用,使之处于生存竞争的优势地位,有利于扩大自己的生存空间和种群数量[7]。研究化感作用可了解生态系统中植物群落的发生、发展和演替规律,调控植物的种群结构和生长发育,减轻化感危害[8]。
重庆市石柱县是黄连的主产地之一,其产量约占我国的60%或全球的40%。但是,集约化栽培黄连对农业生态系统影响,如土地持续生产力,尤其对后继作物的危害鲜有报道。为此,选择当地主要种植的后继作物(莴苣、白菜和绿豆)为研究对象,探讨黄连须根浸提液(extracts from fibrous roots ofC.chinensis, ERC)对其种子萌发、幼苗生长和部分生理指标的影响,旨在了解黄连对其他后继作物的化感效应,为降低化感作用,保持土地生产力提供科学依据。
1.1 供试材料
莴苣(Lactucacompositae)、绿豆(Vignaradiate)、白菜(Brassicarapapekinensis)种子,均为重庆市石柱县的主栽品种,购于重庆市北碚区种子公司。黄连须根(5年生)采集于重庆市石柱县黄连种植园区,小檗碱含量50.20 mg/g。
1.2 试验方法
1.2.1 ERC的制备和试验浓度设计 2012年4月,取黄连须根于(80±1)℃烘干至恒重,粉碎过2 mm筛,准确称取10 g,加100 mL蒸馏水,37℃浸泡48 h后抽滤,滤液用去离子水定容至100 mL,即每1 mL药液含原药0.1 g。
准确吸取母液0,2,4,8,12 mL于1000 mL容量瓶中,用无菌水定容,形成的试验浓度分别为:0,200,400,800,1200 mg/L的ERC,相当于小檗碱 0,10,20,40,60 mg/L。
在培养期,以胚根长度达到1 mm为发芽标准,每隔24 h统计1次种子的发芽数。如连续2 d其发芽种子数无增长,视为发芽完全[10-11],计算种子最终发芽率、发芽指数和活力指数。其中:
最终发芽率FG(rate of final germination)=(发芽的种子总数/供试种子总数)×100%
发芽指数GI(germination index)=∑Gt/Dt
活力指数VI(vitality index)=GI×S
式中,Dt为发芽日数,Gt为在Dt日的发芽数;GI为发芽指数,S为单株幼苗长度(cm)。
在培养结束时,测定苗高、最大根长。同时,用TTC法测定根系活力[9],磺胺-萘胺比色法测定叶片的硝酸还原酶活性[9],丙酮浸提-分光光度计法测定叶绿素含量[9]。另外,用H2SO4-H2O2消煮,凯氏定氮法和钒钼黄比色法分别测定幼苗的全氮和全磷含量[9]。
1.2.3 ERC对种子萌发时内含物的影响 选取大小均匀一致的莴苣、绿豆和白菜种子,用10%H2O2消毒1 min后,洗净,置于100 mL烧杯中(各100粒种子),分别加入0,200,400,800,1200 mg/L ERC溶液(4次重复),25℃吸涨48 h。然后,取出“露白”的种子,用去离子水冲洗,1份磨细消煮,用常规方法[9-10]测定种子中的粗蛋白、全磷和淀粉含量;另1份磨细、沸水提取30 min,分别用蒽酮比色法[10]、水合茚三酮法[10]和钼锑抗比色法[10]测定上清液中可溶性糖、游离氨基酸和可溶性磷的含量。
1.3 数据处理
分别用Excel和DPS 6.50软件对试验数据进行基本计算和统计分析,LSD进行多重比较,显著水平为P<0.05。
2.1 ERC对种子发芽的影响
“等等,把逃兵送师部,我到想听听他为什么要当逃兵,也想听听他是怎么躲过鬼子毒气弹的。”赵锡田做了个停止的动作。
表1可见,与对照相比,200 mg/L ERC对莴苣和绿豆种子的发芽率和发芽指数无显著影响,但400 mg/L ERC显著降低它们的发芽率;800 mg/L ERC处理的白菜种子发芽率和发芽指数均显著低于对照。说明随着ERC浓度增加,3种作物的发芽率和发芽指数降低。白菜种子的方差分析小于另外两种供试种子,表明白菜对ERC的耐受性大于莴苣和绿豆。
活力指数是反映种子正常发芽的综合指标。用200 mg/L ERC处理供试种子,对3种作物种子的发芽率、发芽指数无显著影响,但它们的活力指数分别降低了48.7%(莴苣)、25.3%(绿豆)和7.8%(白菜),种子发芽的活力指数对ERC更为敏感,200 mg/L ERC就能显著影响种子发芽的整齐度和幼苗的健康程度。
2.2 ERC对幼苗生长及生理指标的影响
从表2可见,ERC对莴苣、绿豆和白菜幼苗的生长均表现出抑制作用,并随ERC浓度的增加,抑制强度不断增大。与对照相比,ERC显著降低幼苗生长高度、最大根长和生物量,在低浓度(200 mg/L)时,3种供试作物最大根长明显变短;随着浓度增大,根尖向上卷曲,离开ERC液体,同时根毛消失、畸形、颜色变为褐色;用1200 mg/L ERC浸种后,3种作物的幼芽几乎不能长出,与对照相比,苗高分别下降了79.2%(莴苣),67.6%(绿豆)和35.3%(白菜),最大根长分别下降了91.7%(莴苣), 85.1%(绿豆)和87.3%(白菜),生物量分别下降37.0%(莴苣),35.5%(绿豆)和32.4%(白菜)。
表1 ERC对莴苣、绿豆和白菜种子发芽特性的影响(平均值±标准差)
注:同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05);下同。
Note: In each column, data followed by different small letters are significantly different atP<0.05, the same below.
与对照相比,200 mg/L ERC显著降低莴苣根系活力,但对另外两种供试作物的根系活力无显著影响;当ERC浓度达到400 mg/L时显著降低3种幼苗的根系活力,当ERC浓度高于800 mg/L,根尖生长点变黑死亡,根系活力很低,当浓度到达1200 mg/L时几乎检测不到根系活力,表明ERC对根系的毒性大。
与对照相比,在200和400 mg/L ERC的处理中,ERC对供试作物叶片硝酸还原酶活性无显著影响,但随着ERC浓度增高,叶片硝酸还原酶活性显著降低;当浓度为1200 mg/L ERC时,莴苣、绿豆和白菜叶片硝酸还原酶活性分别比对照下降了27.8%,9.6%和16.9%,表明高浓度的ERC影响到叶片中氮素转化与利用。
除莴苣外,200和400 mg/L ERC对绿豆和白菜的叶绿素含量无显著影响;但当ERC浓度达到800 mg/L时,3种作物的叶绿素含量显著降低;在ERC浓度为1200 mg/L时,莴苣,绿豆和白菜的叶绿素含量分别比对照下降了24.4%,22.8%和32.7%。
表2 ERC对莴苣、绿豆和白菜幼苗生长及生理指标的影响(平均值±标准差)
2.3 ERC对种子萌芽时内含物的影响
2.3.1 ERC对种子游离氨基酸和粗蛋白的影响 表3可见,与对照相比,低浓度(200 mg/L)的ERC显著降低莴苣种子游离氨基酸含量,但对绿豆和白菜种子中的游离氨基酸含量无显著影响;当ERC浓度达到400 mg/L时显著降低3种供试种子游离氨基酸含量;随着ERC浸种浓度的增大,种子中的游离氨基酸含量显著下降。
对照处理中种子的粗蛋白含量最低,随ERC浓度增加,供试种子中的粗蛋白含量逐渐增加,当ERC为1200 mg/L时,莴苣、绿豆和白菜种子中的蛋白质含量分别比对照增加了63.51%,18.76%和33.48%。表明ERC显著影响萌芽种子粗蛋白的分解转化,对莴苣种子氮转化的影响高于另外两种供试作物。
2.3.2 ERC对种子可溶性糖和淀粉含量的影响 表3可见,与对照相比,200 mg/L ERC显著降低莴苣种子中可溶性糖的含量,并随浓度增大显著下降;在800 mg/L ERC浓度下,绿豆和白菜种子明显下降,表明ERC对莴苣种子的不利影响高于另外两种供试种子,当ERC浸种浓度增大到1200 mg/L时,莴苣、绿豆和白菜种子中的可溶性糖含量分别比对照降低了49.4%,22.6%和24.5%。
与对照相比,低浓度的ERC处理(200 mg/L)对白菜种子中的淀粉含量无显著影响,但明显干扰了莴苣和绿豆种子中淀粉的水解。随着ERC浓度的增加,3种供试种子中的淀粉残留量更高,如1200 mg/L ERC处理的莴苣、绿豆和白菜种子,分别比对照少分解85.04%,35.01%和76.42%的淀粉,表明ERC显著影响种子萌发时淀粉的水解。
2.3.3 ERC对种子可溶性磷和全磷含量的影响 表3可见,对照种子中可溶性磷含量最高,但随着ERC浓度提高,3种供试种子的可溶性磷含量明显降低,当ERC达到1200 μg/mL时,3种供试种子中的可溶性磷分别降低了24.1%(莴苣),36.3%(绿豆)和58.4%(白菜)。说明ERC显著影响种子萌发时植酸磷酸盐的水解,对白菜的影响大于其他两种供试种子。
表3 ERC对莴苣、绿豆和白菜种子萌芽时内含物的影响(平均值±标准差)
全磷含量的变化没有其他内含物指标的变化显著,随着ERC浓度提高,3种供试种子的全磷含量也没有显著变化。当ERC达到1200 μg/mL时,3种供试种子中的全磷分别降低了4.76%(莴苣),3.23%(绿豆)和4.35%。
在生产实践中发现,集约化种植黄连抑制后季作物生长,造成减产。黄连须根浸提液达到1000 mg/L时,黄连幼苗的生长受到严重影响。重庆市石柱县黄连产量0.15~0.60 kg/m2,收获时残留于土壤中的黄连须根大于15%,以此作为本试验黄连须根浓度设计的依据。本试验表明,ERC抑制3种供试种子的萌发。尽管低浓度的ERC对莴苣,绿豆和白菜的幼苗生长没有显著影响,但浓度高于400 mg/L(相当于小檗碱20 mg/L)时则抑制它们的幼苗生长,其抑制作用随浓度的提高而增强。由此可以解释集约化种植黄连抑制后季作物生长,并造成减产的现象。据报道,小檗碱是黄连中的有效成分之一,能与它们的主要靶点-膜蛋白发生非特异性结合,导致细胞膜的通透性改变,进而弥散进入细胞内,与细胞核膜上的磷脂成分结合,导致细胞器消失,对细胞的毒性极强。但是,从生态学角度看,在黄连生长过程中,释放的化感物质对周围的其他植物产生有害作用,使之处于生存竞争的优势地位,有益于自己的生长发育,扩大自身生存空间和种群数量[11]。研究化感作用可了解生态系统中,植物群落的发生、发展和演替规律,调控植物的种群结构和生长发育,减轻化感危害[12]。从根系形态上看,在较高浓度的ERC溶液中,根尖向上卷曲,离开ERC溶液,说明ERC对植物根系具有毒害作用,但植物根系也能主动避免与有害物质的接触。相对而言,ERC对白菜种子发芽和幼苗生长的影响小于莴苣和绿豆。实验现象表明,黄连在生长过程中释放的小檗碱,含量最高,为5%~8%, 其次为黄连碱、甲基黄连碱、掌叶防己碱等,对植物根系具有很强的毒害作用,它抑制作物种子萌发(例如莴苣,绿豆和白菜),使种子发芽率,发芽指数,活力指数显著降低。因此,在收获黄连后的土壤上种植白菜可能减少产量和经济损失。
种子在萌发过程中,胚乳中的淀粉,蛋白质和磷酸盐发生水解,其产物是单糖、氨基酸和无机磷,然后再经合成作用构建植物体[13-14]。在逆境条件下,植物体内的水解酶活性增强,合成酶活性降低,多糖、蛋白质和磷酸盐的分解速率大于合成,体内可溶性糖、游离氨基酸和可溶性磷含量增加[15-17]。在本试验中,ERC显著降低了种子中的可溶性糖、游离氨基酸和可溶性磷的含量。根据莴苣,绿豆和白菜种子发芽和幼苗生长也受到抑制,以及淀粉和蛋白质含量因ERC浓度提高而增加的现象,推测在3种植物种子发芽过程中,ERC中的活性物质可能抑制了胚乳中淀粉,蛋白质和磷酸盐的水解,或加速细胞内葡萄糖的酵解,导致种子萌发率降低[18-21]。此外,在作物种子中,氮磷主要以蛋白质和六磷酸肌醇的形式存在。在种子发芽时,种子内的蛋白酶和磷酸酶水解蛋白质和磷酸盐,形成氨基酸和无机磷,供幼苗利用[22]。ERC抑制胚乳中的养分利用,抑制萌发过程中的蛋白酶和氧化戊糖磷酸途径中的磷酸酶活性,使发芽率显著降低,正常生长发育受到抑制,导致植物不能很好地吸收土壤养分,造成作物减产。
据报道,植物根系分泌的化感物质可以改变硝酸还原酶(NR)、谷氨酰合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、吲哚乙酸氧化酶(IAAO)等多种酶的活性,影响相关代谢途径[23]。在旱地土壤中,无机氮以硝态氮为主,硝酸还原是植物利用硝态氮的原初反应,硝酸还原酶是植物利用硝态氮的关键酶之一[24-25]。ERC总体上抑制莴苣、绿豆和白菜3种植物幼苗的硝酸还原酶活性和根系活力,在大田条件下可能不利于植物吸收利用土壤中的硝态氮和多种养分,这可能是集约化种植黄连抑制后季作物生长,造成减产的重要原因之一。此外,ERC显著降低叶片叶绿素(chlorophyll)含量,推测幼苗体内的叶绿素合成也受到抑制。而叶绿素是一类与光合作用(photosynthesis)有关的最重要的色素[26]。光合作用是通过合成一些有机化合物将光能转变为化学能的过程。叶绿素能从光中吸收能量,然后能量被用来将二氧化碳转变为碳水化合物。试验证明,黄连生物碱可通过根系分泌、叶片淋洗进入土壤,抑制后继作物叶绿素的合成,影响到光合作用,导致植株发育不良,这同样也是造成后继作物减产的重要原因之一。
综上所述,较高浓度的ERC抑制莴苣、绿豆和白菜种子发芽,幼苗生长,胚乳养分利用以及硝酸还原酶和根系活性。由此可以解释集约化种植黄连影响后继作物生长,并造成减产的现象,深入研究黄连的化感机理可能为消除化感效应提供有效途径。
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Allelopathic effect of extracts from the fibrous roots ofCoptischinensisonLactucacompositae,VignaradiateandBrassicarapapekinensis
WANG Ya-Qi, CHEN Dan-Mei, YUAN Ling*
CollegeofNaturalResourcesandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China
A study has been undertaken of the allelopathic effect of extracts from fibrous roots ofCoptischinensis(ERC) on seed germination and seedling growth inLactucacompositae,VignaradiateandBrassicarapapekinensis. Seeds of the three species were cultured in plates with various concentrations of ERC and germination rate, young seedling growth and related physiological indexes were measured. There was no significant effect of ERC on seed germination rate and index at low concentrations (200 mg/L), but seed vitality decreased and seedling biomass and root vitality dropped greatly. As the concentration of ERC increased to>400 mg/L, seed starch and protein hydrolyses were inhibited and the contents of free amino acids, soluble sugars and soluble phosphorus decreased, resulting in poor germination. When ERC concentration reached 800 mg/L, roots deformed concomitantly with brown color, root hair disappearance and the curling-up of root tips to leave the ERC solution. Nitrate reductase activity and chlorophyll concentration also decreased in the leaves. As a result, seedling growth was stunted. Stronger inhibition of ERC onL.compositaewas observed than onV.radiateandB.rapapekinensis. The results thus show that allelopathic chemicals contained in root exudate and residual ofC.chinensiscould inhibit seed germination and seedling growth in these three plants. This inhibition could result in poor growth and yield reduction of consequent crops after intensive cultivation ofC.chinensis.
Coptischinensis; extracts of fibrous root; vegetable plants; allelopathic effect
10.11686/cyxb2014287
http://cyxb.lzu.edu.cn
2014-06-19;改回日期:2014-10-27
国家”973 “计划项目(2013CB127405)资助。
王亚麒(1992-),男,宁夏银川人,在读硕士。E-mail:418626455@qq.com *通讯作者Corresponding author. E-mail: lingyuannh@aliyun.com
王亚麒,陈丹梅,袁玲. 黄连须根浸提液对莴苣、绿豆和白菜的化感效应. 草业学报, 2015, 24(6): 142-149.
Wang Y Q, Chen D M, Yuan L. Allelopathic effect of extracts from the fibrous roots ofCoptischinensisonLactucacompositae,VignaradiateandBrassicarapapekinensis. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 142-149.