七氟醚对幼鼠获取空间学习记忆能力及海马pERK1/2表达的影响

刘艳军，余相地，汤和青，袁华平，陈 春

（三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院麻醉科，湖北 宜昌 443003）

七氟醚对幼鼠获取空间学习记忆能力及海马pERK1/2表达的影响

刘艳军，余相地，汤和青，袁华平，陈 春

（三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院麻醉科，湖北 宜昌 443003）

目的 探讨七氟醚对幼鼠获取空间学习记忆能力及海马pERK1/2表达的影响。方法出生后14 d SD幼鼠54只，随机分为对照组(C组)、七氟醚5%组(Sevo组)、假手术组(Sham组)各18只。C组不做任何处理，Sevo组幼鼠暴露于5%的七氟醚4 h，Sham组幼鼠吸入氧气4 h，1周、3周、6周后于上午8:00～11:00应用Morris水迷宫对幼鼠进行7 d的行为学观察，记录逃避潜伏期，行为学结束后随即取出6只幼鼠用免疫组化法测定海马CA1区神经元pERK1/2的表达。结果与Sham组比较，Sevo组逃避潜伏期和探索时间明显延长(P＜0.01)，Sevo组海马CA1区神经元pERK1/2的表达明显减少(P＜0.01)；Sham组与C组逃避潜伏期时间差异无统计学意义，海马CA1区神经元pERK1/2的表达之间差异无统计学意义。结论七氟醚对幼鼠获取空间学习记忆能力的影响与抑制海马pERK1/2表达有关。

七氟醚；海马；pERK1/2；空间学习；记忆能力

七氟烷广泛用于小儿吸入麻醉诱导，无刺激性，血(气)分配系数低，麻醉诱导迅速平稳，苏醒快，麻醉深度易于调控；但有研究发现暴露于麻醉药的新生动物会导致发育中的神经元凋亡，影响其以后的记忆和学习能力，因此研究七氟醚对幼鼠获取空间学习记忆能力的影响及机理有重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物、模型建立及分组 出生后14 d SD幼鼠54只，随机分为对照组(C)、七氟醚5%组(Sevo组)、假手术组(Sham组)各18只。C组不做任何处理，Sevo组大鼠用特制面罩吸入七氟醚后行颈正中气管切开插管，接小动物呼吸机辅助呼吸，将七氟醚用输液微量泵泵入吸入气路中，通过麻醉气体检测仪持续测定，调整泵速，维持呼气末七氟醚浓度在5最低肺泡有效浓度(MAC)值；Sham组行颈正中气管切开插管，接小动物呼吸机辅助呼吸，吸入空气。

1.2 行为学测定 实验时将大鼠从4个不同的入水点面向池壁放入水中，水迷宫的图像自动监视系统追踪大鼠的游泳轨迹(时间≤120 s)，并记录大鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期，Escape latency)，找到后允许动物在平台上停留30 s；如果大鼠在120 s内未找到平台，由实验者将其引至平台，让其在平台停留30 s，再进行下次实验。以逃避潜伏期作为观测指标，120 s内未找到平台者记为120 s。每7 d成绩的平均值为当日成绩。测试过程中保持实验室内灯光、物品等空间参照物摆放位置不变，水温保持在(25±1)℃，以排除干扰因素。

1.3 免疫组织化学测定 Ⅱ套切片采用SP法测定大鼠海马神经元pERK1/2的表达，切片依次脱蜡至水，3%过氧化氢孵育10 min，三蒸水洗5 min×3次。磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.14)浸泡5 min，高压修复3 min，自然冷却至室温。三蒸水洗5 min×3次，滴加1:100 pERK1/2抗体，放入4℃冰箱过夜。PBS冲洗5 min×3，擦干组织周围水分，加对应的二抗，室温孵育2 h；三蒸水洗5 min×3次，擦净切片周围水分后，二氨基联苯胺(DAB)显色5 min、苏木素复染、脱水、透明、封片。

2 结果

2.1 各组幼鼠逃避潜伏期时间比较 与Sham组比较，Sevo组幼鼠暴露于5%七氟醚4 h后，幼鼠逃避潜伏期时间较Sham组明显延长(P＜0.05)；与C组比较，Sham组幼鼠逃避潜伏期时间差异无统计学意义，见表1。

表1 各组幼鼠逃避潜伏期时间比较(±s，s，n=18)

表1 各组幼鼠逃避潜伏期时间比较(±s，s，n=18)

注：与Sham组比较，aP＜0.05。

组别C组Sevo组Sham组6周70.41±12.7 96.71±11.3a73.87±17.4 1周103.15±16.7 110.75±18.4a100.97±17.4 3周90.78±15.3 100.74±16.6a89.79±21.3

2.2 各组海马CA1区pERK1/2表达OD的比较 Sevo组幼鼠暴露于5%七氟醚4 h后，第1周海马CA1区pERK1/2蛋白表达开始降低，第6周降至最低，但组内各时间点表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)。Sham组组内各时间点pERK1/2蛋白表达没有明显变化。Sevo组各时间点CA1区pERK1/2的表达水平均明显低于Sham组(P＜0.05)。与C组比较，Sham组海马CA1区pERK1/2蛋白表达差异无统计学意义，见表2。

表2 各组海马CA1区pERK1/2表达OD的比较(±s，n=18)

表2 各组海马CA1区pERK1/2表达OD的比较(±s，n=18)

注：与Sham组比较，aP＜0.05。

C组Sevo组Sham组0.109±0.036 0.101±0.044a0.107±0.054 0.110±0.043 0.095±0.036a0.111±0.023 0.108±0.042 0.081±0.027a0.109±0.012

3 讨论

七氟醚作为一种新型的吸入麻醉药，对于发育中的大脑，是否能够引起海马神经元的凋亡，对pERK1/2是否有抑制作用，国内外尚无文献报道。本研究发现七氟醚可以明显抑制海马pERK1/2的表达，并对幼鼠获取空间学习记忆能力产生一定的影响。

研究发现pERK1/2是脑发育过程中的重要蛋白质分子，氯胺酮和异丙酚会降ERK1/2和Akt的磷酸化水平，导致凋亡，影响神经元生长与发育。锂能恢复ERK1/2和Akt的磷酸化水平，可以阻止氯胺酮和异丙酚引起的凋亡[1]。NMDA受体的激活，无论是用NMDA还是直接激活神经元，都会激活不同的神经传导通路，有利于神经元的存活；相关的机制包括钙调蛋白激酶[2]、Akt[3]和ERK1/2[4]的激活，脑源性神经营养因子[5]的释放以及对葡萄糖合成激酶3β的抑制作用[6]。氯胺酮对pERK1/2和pAkt抑制作用是通过NMDA受体的，异丙酚也可以通过NMDA受体而抑制神经元的激活。锂能够恢复pERK1/2的磷酸化水平，并达到抑制凋亡的目的。此外，锂抑制凋亡对于正常的脑的发育也有重要作用。在脑发育期间，脑细胞的产生往往超过了正常需要；成人脑细胞的最终数量往往是特定神经元的存活和过多神经元的凋亡[7]。pERK1/2及其相关信号转导通路对于对于发育中的大脑获取空间学习记忆能力能有着重要的作用，因此本研究选择pERK1/2作为研究目标。本研究发现七氟醚与先前研究的很多麻醉药一样，对于幼鼠海马中pERK1/2的表达产生一定的抑制作用，从而影响其学习记忆能力。

本研究的发现提示，七氟醚对幼鼠学习记忆能力会产生的一定程度的影响，其影响与抑制海马pERK1/2的表达有关。

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Effects of Sevoflurane on spatial learning and memory ability and the expression of pERK1/2 in hippocampal in neonatal SD rats.

LIU Yan-jun,YU Xiang-di,TANG He-qing,YUAN Hua-ping,CHEN Chun.
The First College of Clinical Medical Science,China Three Gorges University,Yichang Central People's Hospital,Yichang 443003,Hubei, CHINA

ObjectiveTo investigate effects of sevoflurane on spatial learning and memory ability and the expression of pERK1/2 in hippocampal in young SD rats.MethodsFifty-four young SD rats were randomly divided into three groups:Control group(C group),Sevoflurane group(Sevo group)and Sham operation group(Sham group), each with 18 rats.The rats in Sevo group were exposed in 5%sevoflurane for 4 hours,and the rats in S group were exposed in oxygen for 4 hours.Rats in three groups were taken to carry out the ethology observation for 7 days with Morris water maze 24 hours in 8:00～11:00 after 1 week,3 weeks and 6 weeks of sevoflurane exposing,and the expression of pERK1/2 was determined by immunochemistry.ResultsCompared with Sham group,the escape latency was significantly longer in Sevo group,and the expression of pERK1/2 was significantly inhibited in Sevo group(P＜0.01). There was no statistically significant difference between C group and Sham group in the escape latency and the expression of pERK1/2.ConclusionEffect of sevoflurane on spatial learning and memory ability of young SD rats is related to inhibition of pERK1/2 expression.

Sevoflurane;Hippocampus;pERK1/2;Spatial learning;Memory ability

R-332

A

1003—6350（2015）02—0161—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.02.0057

2014-07-28)