肺腺癌组织中Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin的表达及意义

肖高芳，丁 宇，高双全，杜日昌，李 静，黄 伟，王林辉，徐 彤

(韶关市粤北人民医院病理科，广东 韶关 512026)

肺腺癌组织中Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin的表达及意义

肖高芳，丁 宇，高双全，杜日昌，李 静，黄 伟，王林辉，徐 彤

(韶关市粤北人民医院病理科，广东 韶关 512026)

目的 探讨Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白在肺腺癌组织中的表达及三者之间的关系。方法采用免疫组化S-P法检测72例肺腺癌组织中Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表达情况，并结合临床病理资料分析Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin表达的相关性。结果(1)肺腺癌组织中Cripto-1、ZEB-l和E-cadherin的表达率分别为54.17%、58.33%、36.11%，癌旁肺组织分别为20.00%、22.50%、92.50%，三种蛋白在肺腺癌组织和癌旁肺组织中的表达差异均具有统计学意义(P＜0.01)。(2)肺腺癌组织中Cripto-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表达与肺腺癌肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移有相关性(P＜0.05)。(3)肺腺癌组织中Cripto-1的表达与ZEB-1的表达呈正相关(P＜0.05)，Cripto-1、ZEB-1的表达与E-cadherin的表达呈负相关(P＜0.05)。结论Cripto-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌发展、浸润和转移中发挥重要作用，联合检测三者能更好地评估肺腺癌患者的预后。

肺腺癌；Cripto-1；ZEB-1；E-cadherin；免疫组织化学

肺癌是当今世界范围内肿瘤死亡的首要原因，远处转移和肿瘤生成是肿瘤进展和致死的两个最主要的决定因素。我国是世界上肺癌患者最多的国家，近年来肺癌发病率和病死率一直呈上升趋势，为此，必须寻找更加精确、有效的分子标志物，以期早期发现肿瘤，为肺癌的预后判断以及靶向治疗等提供科学资料。

人Cripto-1(CR-1)又称畸胎癌衍生生长因子-1 (Teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)，它被认为是一个癌胚基因，主要表达于胚胎早期发育阶段，当细胞发生转化或恶变时又重新表达。研究表明CR-1过表达于人类多种恶性肿瘤(如乳腺癌、肺癌、胃癌、宫颈癌等)中，且其表达水平与肿瘤浸润深度及淋巴结转移有关。肿瘤上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一个多步骤的过程，指肿瘤细胞丧失上皮细胞的特性，获得运动和侵袭能力。ZEB-1(Zinc finger E-box-binding protein1)是一种锌指结合蛋白，有学者研究发现ZEB-1与多种肿瘤的发生、发展有密切关系，并且ZEB-1参与了EMT的调节过程。本研究通过检测肺腺癌组织中CR-1的表达情况，同时联合检测EMT相关因子ZEB-1和E-cadherin的表达，探讨CR-1在肺腺癌发生、发展及其转移中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集韶关市粤北人民医院2010年8月至2014年8月肺腺癌手术切除标本72例作为观察组，其中男性40例，女性32例，年龄38～78岁，中位年龄55岁；其中高～中分化44例，低分化28例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期27例；组织学分型：腺泡型20例，实体型18例，乳头型25例，其他9例；有淋巴结转移者43例，无淋巴结转移者29例。随机选择40例癌旁肺组织作为对照组。所有患者术前均未接受放化疗和免疫治疗等治疗，且临床资料齐全。

1.2 主要试剂 浓缩型兔抗人单克隆抗体CR-1、ZEB-1购自Santa Cruz公司，即用型兔抗人单克隆抗体E-cadherin、免疫组化S-P试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 方法 所有标本均用10%中性缓冲福尔马林固定，脱水、石蜡包埋，切片机4 μm连续切片，分别用于免疫组化及常规HE染色。应用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P法)检测肺腺癌组织中CR-1、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表达水平。

1.4 结果判定标准 免疫组化判定标准：(1) CR-1蛋白：定位于肿瘤细胞质，呈棕黄色颗粒状，判定时需综合考虑阳性细胞染色强度和比例。阳性强度：无着色0分,浅着色1分，中等着色2分，强着色3分。阳性细胞所占比例分为：＜l%0分，1%～3%1分，3%～67%2分，＞67%3分，阳性强度和阳性细胞所占比例得分相加为最后得分：0分为阴性，l～2分为(+)，3～4 (++)，5～9分为(+++)；(2)ZEB-1阳性结果判定：定位于肿瘤细胞核内，弥漫染色，按着色度计分：无着色0分，淡黄色1分，黄色2分，棕褐色3分；≥1分计为阳性，＜1分计为阴性。(3)E-cadherin：定位于肿瘤细胞膜，无着色0分，1%～25%l分，26%～75%2分，＞75%3分；0～1分为阴性，2～3分为阳性。免疫组化结果判读采用双盲法，由三位病理医生独立观察后取平均值。

1.5 统计学方法 实验结果应用SPSS17.0统计软件进行分析，免疫组化结果和临床病理资料之间采用χ2检验，应用Spearman非参数相关分析CR-1、ZEB-1和E-cadherin表达的相关性，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化染色检测 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌及正常肺组织中的表达 肺腺癌组织中CR-l主要在细胞质表达(图1A)，肿瘤组织CR-1阳性率(54.17%)高于癌旁肺组织(20.0%)，ZEB-l主要在肿瘤细胞核表达(图1B)，肿瘤组织ZEB-1阳性率(58.33%)高于癌旁肺组织(22.5%)，E-cadherin主要在细胞膜表达(图1C)，肿瘤组织E-cadherin阳性率(36.11%)低于癌旁肺组织(92.5%)，差异均具有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

图1 肺腺癌组织中CR-1、ZEB-1和E-cadherin的表达

表1 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌及正常肺组织中的表达[例（%）]

2.2 CR-1、ZEB-1和E-cadherin在肺腺癌中的表达与患者临床病理特征的关系 肺腺癌组织中CR-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白的表达与肺腺癌肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移密切相关，差异具有统计学意义(P＜0.05)，肺腺癌组织中三者的表达与患者性别、年龄和肿瘤组织学类型无关(P＞0.05)，见表2。

表2 CR-1的表达及其与肺腺癌临床病理特征的关系[例（%）]

2.3 肺腺癌中CR-1、ZEB-1和E-cadherin的相关性分析 Spearman相关分析结果显示，肺腺癌组织中CR-1的表达与ZEB-1呈正相关(r=0.279，P＜0.05)，CR-1的表达与E-cadherin呈负相关(r=-0.237，P＜0.05)，ZEB-1的表达与E-cadherin亦呈负相关(r=-0.244，P＜0.05)，见表3。

表3 肺腺癌中CR-1与ZEB-1、E-cadherin的相关性分析(例)

3 讨论

CR-1蛋白最开始是从人类胚胎癌细胞中分离提取出来，因其含有修饰的EGF样结构域被归类于EGF相关肽家族中，它是一种由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白质，是转化生长因子TGF-β蛋白亚家族成员Nodal、GDF-1和GDF-3配体的共同受体，在早期胚胎发育和细胞转化过程中发挥重要作用[1]。研究发现CR-1在肿瘤生长过程中通过影响细胞的增殖、存活、肿瘤细胞迁移侵袭、上皮-间质转化(EMT)和血管形成等发挥致瘤基因的作用[2-7]。CR-1在早期胚胎发育时期表达，成年人体组织中CR不表达或仅有低水平表达[8-13]，然而在大多数恶性肿瘤，如乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌和宫颈癌等，CR-1却异常高表达[6，13]，因此CR-1被认为是肿瘤免疫治疗的一个潜在的特异性靶点。应用转基因动物模型研究发现CR-1通过下调细胞表面粘连蛋白(E-cadherin等)、上调间质标记物(比如Vimentin、N-cadherin和Snail)的表达，即发生EMT从而促进乳腺肿瘤的发生。此外，有文献报道CR-1能富集胚胎、黑色素瘤、前列腺和胰腺等肿瘤细胞中具有干细胞特性的细胞，它可能参与了EMT介导的已分化的肿瘤细胞向肿瘤干细胞重编程的过程。

ZEB-1的编码基因位于人类10号染色体短臂，主要结构特点是C端和N端都有C2H2锌指结构簇和位于中间的一个同源结构域，它是Snail超家族(包括Snail、Slug、ZEB-1、ZEB-2等)中的一员。有学者发现在乳腺癌、骨肉瘤、胃癌中，ZEB-1作为一种转录抑制因子，ZEB-1可能通过增强肿瘤细胞的迁移能力，在肿瘤细胞的EMT过程中起重要作用[14-17]。近年来研究证实，ZEB-1与其他诱导EMT的转录因子(比如Twist、Snail、Slug和SIP)一样，通过与E-cadherin编码基因CDH1的E-box(CACCTG)序列结合，使其转录下调，促进EMT的发生，从而增强肿瘤细胞侵袭和转移能力[18]。有研究发现ZEB-1在子宫内膜癌、结肠癌和前列腺癌中均异常表达，且与肿瘤的进展、肿瘤细胞分化程度低下、肿瘤的远处转移和预后不良相关[19-21]。还有学者研究发现肝细胞性肝癌组织中ZEB-1阳性表达，而E-cadherin表达缺失，且与肝癌患者不良预后有关，得出的结论是ZEB-1阳性表达诱导EMT发生以致肿瘤组织恶性程度高[22]。

EMT在肿瘤进展、转移和肿瘤细胞耐药性方面发挥重要作用，发生EMT的标志是细胞表面连接蛋白E-cadherin和紧密结合蛋白Occludins和Claudins表达下调，代之以Vimentin、Fibronectin和/或N-cadherin表达上调，导致细胞连接不稳定，使细胞获得运动特性。E-cadherin是钙粘蛋白家族中的一个重要成员，广泛分布于各类上皮细胞表面，具有促进上皮细胞间相互粘附，维持上皮组织完整性和上皮细胞极性的功能，其表达下调促进EMT的发生，从而导致肿瘤恶性进展和不良预后。

本研究结果显示，肺腺癌组织中CR-l、ZEB-1和E-cadherin蛋白表达与肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移均显著相关，高～中分化肿瘤组织中CR-l和ZEB-1的表达明显高于低分化肿瘤组织，临床分期Ⅲ～Ⅳ期CR-l和ZEB-1的表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移者CR-l和ZEB-1的表达明显高于无淋巴结转移者；高～中分化肿瘤组织中E-cadherin的表达明显低于低分化肿瘤组织，临床分期Ⅲ～Ⅳ期E-cadherin的表达明显低于Ⅰ～Ⅱ期，有淋巴结转移者E-cadherin的表达明显低于无淋巴结转移者，表明CR-1、ZEB-1和E-cadherin可能在肺腺癌的浸润和转移过程中起重要作用。此外，CR-1的表达与ZEB-1的表达呈正相关，CR-1和ZEB-1的表达与E-cadherin的表达呈负相关，提示CR-1和ZEB-1可能通过抑制E-cadherin蛋白的表达，使肿瘤细胞间的连接作用减弱，从而降低肿瘤细胞间的粘附力，导致肿瘤细胞失去上皮细胞极性，运动性增强，即肿瘤细胞发生EMT，使肿瘤细胞更容易浸润和转移。

综上所述，CR-1和ZEB-1的上调同时E-cadherin的下调可能在促进肿瘤侵袭转移等方面发挥协同作用，与肿瘤的预后判断有关。CR-1、ZEB-1和E-cadherin三者的联合检测将可能有利于临床上预测肺腺癌患者的预后并为肺腺癌的基因治疗提供新的方法和策略，但有关的作用机制还有待进一步研究。

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Expression and significance of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin in lung adenocarcinoma tissues.

XIAO Gao-fang,DING Yu,GAO Shuang-quan,DU Ri-chang,LI Jing,HUANG Wei,WANG Lin-hui,XU Tong.Department of Pathology,Yuebei People's Hospital,Shaoguan512026,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression levels of Cripto-l,ZEB-1 and E-cadherin proteins in lung adenocarcinoma tissues,and to explore the correlation between these three proteins.MethodsThe expressions of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin proteins were examined by immunohistochemistry in72 samples of lung adenocarcinoma tissues.And the correlation between Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin expression was also analyzed by clinical and pathological data.ResultsThe positive expression rate of Cripto-l,ZEB-1 and E-cadherin were54.17%,58.33%,36.11%respectively in lung adenocarcinoma tissues,and20.0%,22.5%,92.5%respectively in adjacent tissues,with statistically significant differences between two groups(P＜0.01).The expression of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin showed significant correlation with the differentiation,clinical stage and lymph node metastasis(P＜0.05). The expression of Cripto-1 showed a positive correlation with ZEB-1(P＜0.05),while the expression of Cripto-1 and ZEB-1 showed a negative correlation with E-cadherin in the lung adenocarcinoma tissues(P＜0.05).ConclusionExpressions of Cripto-1,ZEB-1 and E-cadherin may be involved in the progression,invasion and metastasis of lung adenocarcinoma.Acombined examination of these three proteins may help evaluate the prognosis of lung adenocarcinoma.

Lung adenocarcinoma;Cripto-1;ZEB-1;E-cadherin;Immunohistochemistry

R734.2

A

1003—6350（2015）16—2351—04

2015-03-01)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0849

韶关市医学科研基金立项(编号：Y14013)

高双全。E-mail：gsq76@tom.com