Artemin蛋白在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系

马耀先

(许昌市中心医院肿瘤科，河南 许昌 461000)

Artemin蛋白在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系

马耀先

(许昌市中心医院肿瘤科，河南 许昌 461000)

目的 探讨Artemin蛋白在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法采用免疫组化法对90例胃癌患者的癌组织及30例胃癌患者的癌旁良性组织中的Artemin蛋白进行检测，统计学分析Artemin蛋白在胃癌组织中的表达，并探讨推测Artemin蛋白与胃癌患者的临床病理特征的关系。同时通过荧光定量RT-PCR法测定胃癌组织与癌旁组织中Artemin mRNA的表达差异。结果Artemin蛋白在胃癌组织中阳性表达率为78.89%，明显高于癌旁良性组织的10.00%，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且Artemin蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌患者的肿瘤浸润程度、淋巴结转移及临床TNM分期有密切关系(P＜0.05)，而与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无关(P＞0.05)；Artemin mRNA在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织7.01倍，推测Artemin参与了胃癌的发生或发展的过程。结论胃癌组织中的Artemin蛋白表达与肿瘤的侵袭转移有密切关系，可作为有效的检测指标来预测分析胃癌的发生、发展及侵袭过程，具体机制有待进一步研究。

胃癌；Artemin蛋白；免疫组化法；临床病理特征

胃癌是我国十大常见恶性肿瘤之一，根据1973-1975年全国人口死因调查及1990-1992年1/10抽样人口死因调查资料显示[1]，胃癌的死亡率仍然居肿瘤死亡之首，占肿瘤中的死因构成23.24%。尽管在全球范围内，胃癌发病率呈下降趋势，但其病死率仍高居世界第2位[2]，仅次于肺癌，其发病率逐年升高，给社会家庭及个人带来了严重的经济损失和心理负担，早期胃癌大多数患者无明显症状，有少数人有恶心、呕吐或类似于溃疡病的上消化道症状，由于现代医疗技术还未能有效的通过相关指标及早发现临床上胃癌的发生，往往会耽误有效的治疗时间而演变成胃癌晚期。

Artemin(ARTN)同GDNF、Neurturin(NTN)及Persephin(PSP)都是胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的家族配体(GFL)，属于转化生长因子β(TGF-β)的超家族，同时ARTN也是分泌性的磷酸化糖蛋白，具有促进细胞趋化、粘附及迁移的作用[3-5]，ARTN与信号转导通路中的分子结合后会产生级联放大效应，在介导肿瘤细胞的侵袭、转移中具有重要意义。本研究旨在采用免疫组化法[6]和荧光定量PCR技术[7]检测Artemin在胃癌组织中的表达，分析ARTN表达强度与肿瘤临床病理特征的关系，探索Artemin在伴随胃癌发生、发展或转移过程中的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年3月至2014年9月在我院进行手术治疗切除的胃癌组织标本90例，其中男性患者40例，女性患者50例，年龄36～77岁，平均(45.5±1.4)岁，患者手术前均未接受化疗、放疗、免疫或放射治疗，术后均经过至少两名病理医师独立进行病理学诊断确诊为胃癌。标本来源病例均具备完整的临床病理特征及随访资料。其中，参照2010年WHO组织学标准[8]分为肠型胃癌与弥漫型胃癌，其中57例肠型胃癌中，乳头状腺癌2例，高分化管状腺癌24例、中分化管状腺癌31例；43例弥漫型胃癌中，印戒细胞癌8例，低分化腺癌35例；参照2010年美国癌症联合会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)修订的第7版TNM分期法[9]对患者进行分类，其中，Ⅰ期18例、Ⅱ期24例、Ⅲ期23例、Ⅳ期25例。同时，选取30例胃癌患者，其中，男性患者12例，女性患者18例，年龄35～75岁，平均（50.5±11.3）岁，取其癌旁组织（即距离胃癌肿瘤5cm以上的周围组织）为对照标本，所有患者手术前均未接受化疗、放疗、免疫或放射治疗，术后均经过至少两名病理医师独立进行病理学诊断确诊为胃癌，且标本来源病例均具备完整的临床病理特征及随访资料。

1.2 纳入标准 目前国内外还没有统一的胃癌纳入标准，由于胃癌缺少特异性的临床症状，且早期胃癌常不具明显症状，患者一般会出现上腹部不适或疼痛、食欲减退、消瘦、乏力、恶心、呕吐或黑便、腹泻、发热、腹部出现肿块等症状，晚期转移时，左锁骨上淋巴结则会伴有肿大现象，这些症状往往会伴随着胃癌的发生、发展过程。临床上胃癌的诊断主要依据胃液检查、大便隐血试验、X线钡餐检查、纤维胃镜检查、影像学以及病理学检查。

1.3 排除标准 (1)没有完整临床病例资料；(2)围手术期死亡者；(3)局部复发及残余的胃癌患者；(4)在术前应用新辅助治疗者。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化法检测Artemin蛋白 标本采集：选取肿瘤中心坏死部分为肿瘤组织标本，距离肿瘤组织边缘5cm以上为癌旁组织，选取该癌旁组织作为正常对照。将组织标本取出立即加入到10%中性甲醛溶液中固定，然后进行常规脱水、石蜡包埋保存。测定步骤：将胃癌组织及癌旁正常组织标本进行石蜡切片进行枸橼酸加热、抗原修复后按照Artemin蛋白(ARTN)检测试剂盒(北京华夏雄风科技有限公司)说明书步骤检测Artemin蛋白。其中，用已知阳性片作为阳性对照，以pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。一抗反应条件为4℃过夜，二抗条件为37℃，孵育30min，添加DAB试剂(北京中衫生物制品有限公司)，显色5min，苏木精富染、脱水、透明并封固。

1.4.2 免疫组化染色结果判定标准 将标本切片置于显微镜下，对所测的视野进行准确定位之后由摄像系统进行图象分析，并由两名病理医师独立进行判定。由于ARTN的阳性表达主要位于细胞质与细胞膜处，因此细胞膜与细胞质染色后出现明显的黄色或者棕黄色颗粒则判定为阳性，随机选取每张切片的5个(×400)的高倍视野，记录阳性细胞百分率，视野无着色细胞则为阴性(-)；阳性着色细胞率＜25%为弱阳性(+)；着色细胞细胞率为25%～50%则为阳性(++)；阳性着色细胞率＞50%为强阳性(+++)。

1.4.3 实时荧光定量PCR检测Artemin mRNA的表达 用Trizol试剂(MIC公司)抽提标本总RNA，以oligo(dT)18为引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)反转录合成CDNA第一链。PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性30 s，69℃退火30 s，57℃30 s、72℃荧光检测1min，重复36个循环，72℃5min，在荧光定量PCR仪(天隆科技有限公司，TL988-Ⅰ型)上进行实时定量PCR检测。引物生成，内参β-actin上游5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，下游5'-ATCTTCAAACCTCCATGATA-3'，产物136 bp。Artemin上游5'-TGGCCGCTCTGG-CTCTGCTGA-3'，下游5'-TGAGGTCTGGTGTCTTTT AGG-3'，产物382 bp。并计算胃癌Artemin mRNA表达的倍数，目的基因的mRNA相对表达水平用2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct值-β-actin基因Ct值)。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Artemin蛋白在胃癌组织及癌旁组织中的表达 免疫组化结果见图1，结合表1可知，在90例胃癌组织中的Artemin阳性71例，其阳性率为78.89%；在30例癌旁组织中Artemin阳性3例，阳性率为10.00%，Artemin在胃癌组织中的阳性率明显高于在癌旁组织的阳性率，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 免疫组化法观察到Artemin蛋白在组织中的表达

表1 Artemin在胃癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 Artemin蛋白在胃癌组织中的表达与其临床病理特征的关系 由表2可知，Artemin蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌患者的肿瘤浸润程度、淋巴结转移及临床TNM分期有密切关系(P＜0.05)，而与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小及分化程度均无关(P＞0.05)。

表2 Artemin在胃癌中的表达与临床病理特征的关系[例（%）]

2.3 Artemin mRNA在胃癌组织及癌旁组织中的表达结果 由表3可知，以癌旁组织中的β-Actin mRNA量为1，计算出Artemin mRNA在胃癌组织中的表达量是在癌旁组织中的7.01倍。

表3 胃癌组织及癌旁组织中Artemin mRNA表达的比较(±s)

表3 胃癌组织及癌旁组织中Artemin mRNA表达的比较(±s)

注：a△Ct=Ct目的基因-Ctβ-Actin。

项目2-△Ct倍数组织细胞类型Ct -△Ctaβ-Actin Artemin癌旁组织胃癌组织癌旁组织21.37±3.7522.57±3.4625.38±5.230 -1.20 -4.011 --7.010.43530.0621

3 讨 论

肿瘤的转移过程是一个多步骤、多阶段的复杂过程，与肿瘤细胞的增殖能力、运转能力及侵袭能力关系密切，且肿瘤细胞极易侵袭性生长、转移和复发。目前关于胃癌的具体发病机制以及其发生发展过程中细胞、基因中的等相关指标变化还未阐明清楚，从基因和蛋白水平出发，现代研究[10-12]已证明，Artemin蛋白、vegf165b重组蛋白、MMP-9、骨桥蛋白、COX-2蛋白、整合素α5β1蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌的发生、发展及淋巴转移等有密切关联。

研究表明[6]，Artemin是由113个氨基酸及7个保守的半胱氨酸残基组成，且倾向于结合GFRα3受体，形成受体复合物，再通过糖基-磷脂酰肌醇结合于细胞膜，激活Ret，进而传递信号，一旦与信号转导通路中的分子结合后将会产生级联放大效应，促进肿瘤的侵袭与转移。临床研究[13-15]也同样发现，Artemin蛋白在胰腺癌中高度表达，在乳腺癌的侵袭转移过程中发挥了至关重要的作用，Artemin蛋白的表达可能与乳腺癌的疾病进展、侵袭和远处转移有密切的联系，Artemin蛋白的表达也能够影响食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

本研究结果Artemin蛋白在胃癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁的良性组织，差异具有显著性意义，提示Artemin蛋白的异常表达与胃癌的发生有一定的关系；Artemin蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌患者的肿瘤浸润程度、淋巴结转移及临床TNM分期有密切关系(P＜0.05)，而与胃癌患者的性别、年龄、肿瘤大小及分化程度无关(P＞0.05)，推测Artemin蛋白的高表达可能是对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭演变过程中的一种反映；Artemin mRNA在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织，推测Artemin蛋白参与了胃癌的发生或发展的过程。

综上所述，Artemin蛋白在一定程度上可能参与了胃癌的发生发展，与胃癌的侵袭转移有关，推测Artemin蛋白可作为监测中国人群胃癌的发生、转移、侵袭及预后情况的有效指标之一，具体的机制有待进一步研究。

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Expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues and its relationship with the clinicopathological features.

MA Yao-xian.Department of Oncology,the Central Hospital of Xuchang,Xuchang461000,Henan,CHINA

ObjectiveTo investigate expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues and its relationship with the clinicopathological features.MethodsThe expression of Artemin protein was detected by immunohistochemistry in gastric carcinoma tissues(from90 patients of gastric cancer,the study group)and peficancerous tissues(from30 patients of gastric cancer,the control group).The relationship of Artemin protein with the clinicopathological features of gastric carcinoma patients was analyzed.The expression difference ofArtemin mRNAin gastric carcinoma tissues and peficancerous tissues was also analyzed.ResultsThe positive expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues was significantly higher than that in peficancerous tissues(78.89%vs10.00%,P＜0.05).The expression of Artemin protein in gastric carcinoma tissues was correlated with TNM stage,infiltration depth and lyrmoh node tastasis(P＜0.05),but not correlated with age,sex,tumor size or degree of differentiation(P＞0.05).The expression of Artemin mRNA in gastric carcinoma tissues was7.01 times higher than that in the peficancerous tissues, which indicates that Artemin plays a role in the development of gastric carcinoma.ConclusionThe expression of Artemin protein in gastric carcinoma significantly correlates with tumor invasion and metastasis,which could be used as one of the indicators for the clinical evaluation of gastric cancer progression and the prognosis of patients.

Gastric carcinoma;Artemin protein;Immunohistochemistry;Clinicopathological features

R735.2

A

1003—6350（2015）16—2355—04

2015-01-28)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0850

马耀先。E-mail：mayaoxian@csco.org.cn