海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究

刘 腾，符乃光，李泽友

（海南医学院药学院，海南 海口 571199）

海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究

刘 腾，符乃光，李泽友

（海南医学院药学院，海南 海口 571199）

目的 分析海南水蛭的品种及其中水蛭素的抗凝作用。方法观察海南水蛭的形态特征、薄层色谱图，并采用凝血酶滴定法测定其抗凝活性。结果海南水蛭为菲牛蛭，水蛭素的抗凝活性分别为：全身1174.8 U/g、头部6521.7 U/g、身体308.6 U/g。结论海南水蛭具有很好的抗凝血活性，值得进一步研究开发。

海南水蛭；水蛭素；薄层色谱；凝血酶

中药水蛭具有抗凝血、抗肿瘤、提高免疫力、降血脂等多种药理活性，临床上用于治疗多种疾病[1]。2010年版《中国药典》一部中记载水蛭的品种为“水蛭科动物蚂蟥W.pigraWhitman、水蛭H.nipponicaWhitman或柳叶蚂蟥W.acranulatawhitman的干燥全体”[2]。蚂蟥与柳叶蚂蟥经现代研究均含有水蛭素(Hirudin，一种多肽)，具有一定的临床疗效[3]，但二者临床疗效均不如吸血水蛭[4]，吸血水蛭在我国产量相对丰富，是不错的药材资源。菲牛蛭(Poecilobdella manillens)是一种吸血水蛭，又称马尼拟医蛭，俗称金边蚂蟥。从菲牛蛭中分离出的生物活性成分菲牛蛭素(Bufrudin)也是一种多肽，由60多个氨基酸组成，分子量7000 Da，氨基酸残基序列有50%～60%与水蛭素相同。它的作用机理与水蛭素、森林山蛭素(Haemadin)相同，都是抑制凝血酶[5]。张彬等[6]对菲牛蛭的抗凝血作用的研究表明菲牛蛭具有较强的体外抗凝血酶活性，且人工养殖对菲牛蛭的抗凝活性未产生不利影响。

随着水蛭临床应用的广泛，医药市场对水蛭的需求量越来越大，进而对水蛭进行相关研究的文献也越来越多，尤其是对广西菲牛蛭的研究。菲牛蛭生活于水田、水沟或池塘里，主要吸食人、畜血液，造成严重危害，是海南岛水田的优势种，密度很大[7]。海南地区温湿度条件非常适合水蛭的生长，水蛭分布密度较广，但至今还没有对海南野生水蛭研究的相关文献，因此，我们对海南野生水蛭进行鉴别及体外抗凝活性测定，以探讨海南野生水蛭作为一种抗凝抗栓药物的运用前景，为海南水蛭的养殖、开发和应用打下理论基础。

1 试剂与仪器

1.1 材料与试剂 海南野生水蛭(海南屯昌县水田抓获)，干燥宽体金线蛭(海南国瑞堂中药制剂有限公司，产地：广西，杨卫丽副教授鉴定)，广西菲牛蛭粉末(养殖户赠送)。人纤维蛋白原(博雅制药，规格0.5 g/瓶，批号：20131220)，凝血酶冻干粉(湖南一格制药，规格500单位，批号：121112-4)，三羟甲基甲烷(西亚试剂，批号：B92407)，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器 冷冻干燥器(CHRIST、型号：ALPHA1-2LD Plus)，粉碎机(黄城，永康市天祺盛世工贸有限公司)，KQ2200E医用超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，飞鸽牌系列TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)，电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司、型号：DK-98-Ⅱ)，精密pH计(PHS-2C，上海大普仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 海南野生水蛭的鉴别

2.1.1 形态特征 个体狭长且扁平，活的背面呈黄褐色，背中有一条不显著地断裂的蓝灰色纵纹，个体较大，进食前最大的体长约110mm，最大体宽12mm，尾部明显小于体宽，尾吸盘背面有分散的不规则色斑，体正侧面各有一条橙黄色的纵带。腹面淡灰色，无斑点及纵纹。

2.1.2 干燥粉碎 将活水蛭室温下加入一定量生理盐水，浸泡30min后蒸馏水充分清洗，-80℃低温冰箱迅速冻死，后将其放置在零下15℃～20℃的冷冻冰箱中进行预冻48 h，至其周围的冰霜有约5mm厚，然后将其迅速放置于真空冷冻干燥设备中，干燥12 h。干燥后的水蛭粉碎处理，得粉末备用。

2.1.3 TLC鉴别[8](1)供试液的制备：取上述水蛭粉末约100 mg，加入1ml生理盐水，超声波提取30min，离心10min(1000 r/min)，取上清液在80℃水浴加热2min备用，用1ml生理盐水做同样处理作为空白溶液。(2)层析板处理：取硅胶G板，105℃活化1 h。(3)薄层条件：将一定量的样品溶液和空白溶液分别用微量注射器点于同一薄层板上，用正丁醇-冰乙酸-水(3.5：2：4.5)为展开剂，立式上行展开12cm，取出，挥去溶剂后喷洒0.2%茚三酮丙酮溶液，在105 C下加热15min，显出紫红色斑点，如图1。由海南水蛭的形态特征和薄层图谱显示可知，海南水蛭是菲牛蛭。

图1 水蛭的薄层色谱

2.2 凝血酶滴定法测定抗凝活性

2.2.1 提取液的制备 分别精密称取水蛭的全身和各自的头部及身体粉末各约1 g，精密加入0.9%氯化钠溶液10ml，充分搅拌，浸提30min，并时时振摇，10000 r/min离心15min，分离上清液，用1.0 mol/L NaCl溶液调节其pH值为5.0[9]，备用。

2.2.2 缓冲液的配制 取0.2 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1 mol/L盐酸溶液40ml，加水至100ml，调节其pH值为7.4，加入0.5 g(人)纤维蛋白原溶解，即得含0.5%(人)纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液。

2.2.3 凝血酶滴定液的配制[10]将100 NIH/ml的凝血酶加入不同体积的0.9%氯化钠溶液，配成不同浓度的凝血酶滴定液。

2.2.4 抗凝血活性测定 分别精密量取水蛭的全身、头部和身体提取液100 μl，置试管(10mm×100mm)中，加入含0.5%(人)纤维蛋白原200 μl，摇匀，置水浴(37±0.5)℃中缓缓滴加凝血酶溶液(5 μl/min，对照液用2 μl/min，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积。

按下式计算含量：U=C1×V1/(C2×V2×W)式中：U为每1 g含凝血酶活性单位(U/g)；C1为凝血酶溶液的浓度(U/ml)；C2为供试品溶液的质量浓度(g/ml)；V1为消耗凝血酶溶液的体积(μl)；V2为供试品溶液的加入量(μl)；W为取样量，抗凝活性测定，见表1。

表1 海南水蛭的抗凝活性测定结果

3 讨 论

3.1 色谱条件的优化 参考丁家欣等[8]的薄层色谱条件，海南水蛭的图和广西菲牛蛭的图几乎一致，但和宽体金线蛭的色谱图区分度也不高。多次实验显示菲牛蛭有时会在溶剂前沿出现一个黄棕色斑点和在比移值为0.81左右出现一个很微弱很淡的浅紫色斑点；但即使在相同的条件下重复试验，这两个斑点也是时有时无，出现的概率大约为30%。故此，我们对条件进行了改进，把提取的TLC供试液均在80℃的水浴中加热2min，然后进行展开显色，色谱图的斑点则表现出较高的区分度。在对提取液加热的过程中，宽体金线蛭提取液出现少量白色沉淀，溶液未变色，菲牛蛭提取液从黑褐色变成棕褐色，且出现大量沉淀。但加热后的上清液均不影响点样和显色。

3.2 薄层色谱的区别 在TLC图谱中，菲牛蛭在前沿有一棕黄色斑点，Rf0.95左右，宽体金线蛭无。而宽体金线蛭在Rf0.62左右有一深紫色斑点，菲牛蛭无，可以区别两种水蛭品种。

3.3 活性测定的条件及优化 抗凝活性测定时，1 g水蛭粉用10ml0.9%NaCl提取和10000 r/min离心15min后效果较好，可以获取澄清的提取液。并且提取液的pH值约为5.5，本身就有利于含量测定的顺利进行，所以滴定时不需再用NaOH溶液调节其pH。水蛭中的水蛭素主要浓集在头部，身体部位的水蛭素含量很少，本试验结果也反映了这一点；如果在测定时滴加凝血酶过快则会导致结果偏低，且身体部位的提取液为深褐色导致刚刚出现白色絮状沉淀时很难发现。所以，延缓滴加凝血酶的间隔时间，采用每隔2min滴加一次，并且适当降低凝血酶浓度，这样可以使滴定终点准确快速的确认和测量结果更加准确可信。

[1]周 乐,赵文静,常惟智.水蛭的药理作用及临床应用研究进展[J].中医药信息,2012,29(1)：132-133.

[2]曾元儿.中国药典.一部[S].2010：77-78.

[3]杨洪雁,杜智恒,白秀娟.水蛭药理作用的研究进展[J].东北农业大学学报,2012,43(3)：128-133.

[4]来复根,金永昌.中药水蛭原动物的本草学考证[J].现代应用药学,1988,5(1)：15.

[5]Electricwala A.Isolation of thrombin inhibitor from the Leech Hirudinaria manillenaia[J].Blood Coagulation and Fibrinolysis,1991,2 (1)：83-89.

[6]张 彬,汪 波,龚 元,等.几种水蛭抗凝血物质提取及活性分析[J].中山大学学报：自然科学版,2012,51(4)：92-96.

[7]杨 潼.中国动物志蛭纲[M].北京：科学出版社,1996：120-122.

[8]丁家欣,张秋海,欧兴长,等.三种水蛭的薄层色谱与电泳法鉴别[J].中药材,1994,17(11)：279-281.

[9]范尚坦,李金兰,张 勇,等.水蛭中水蛭素含量测定的改进[J].中国中药杂志,2008,33(19)：2277-2279.

[10]卢舒凡,李庆国,许淑芹.广东菲牛蛭中有效抗凝物质的分离纯化[J].医学研究杂志,2014,43(5)：104-107.

Study on anticoagulant activity of hirudin in Hainan leech.

LIU Teng,FU Nai-guang,LI Ze-you.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo analyze the species of Hainan leeches and the anticoagulant activity of hirudin.MethodsThe morphological characteristics and thin-layer chromatogram of Hainan leech were observed.Then anticoagulant activity was measured with the method of thrombin titration.ResultsHainan leeches were Hirudinaria manillensis.The anticoagulant activity of Hainan Leech hirudin was1174.8 U/g of whole body,6521.7 U/g of the head and308.6 U/g of the body.ConclusionHainan leeches have very good anticoagulant activity,which deserve further research and development.

Hainan leech;Hirudin;Thin-layer chromatogram(TLC);Thrombin

R282.74

A

1003—6350（2015）16—2345—03

2015-03-07)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0847

海南医学院大学生创业项目(编号：HYCX201240)

李泽友。E-mail：lzy7307@126.com