不同灸温的艾灸抗炎效应及TRPV1作用机制研究❋

周 攀，张建斌，王玲玲，季 辉，谢 波

(南京中医药大学针药结合实验室，南京 210029)

不同灸温的艾灸抗炎效应及TRPV1作用机制研究❋

周 攀，张建斌，王玲玲△，季 辉，谢 波

(南京中医药大学针药结合实验室，南京 210029)

目的:探讨不同灸温对佐剂性关节炎大鼠血清炎症因子的影响及瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)的作用机制。方法:将40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、38℃艾灸组、45℃艾灸组、CPZ+45℃组，每组8只，以弗氏完全佐剂制备佐剂性关节炎模型。后3组于“肾俞”、“后三里”给予每天每穴10 min治疗，控制穴区温度为(38±1)℃或(45±1)℃。CPZ+45℃组先在穴区涂抹TRPV1阻断剂辣椒平CPZ溶液，每10 min涂1次，30 min后再予45℃艾灸治疗。治疗5 d后测定肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β的浓度。结果:模型组TNF-α、IL-1β较空白组显著升高。38℃组TNF-α较模组型降低，而IL-1β无统计学意义，45℃组TNF-α、IL-1β较模型组显著降低。45℃组TNF-α、IL-1β较38℃组明显降低。CPZ+45℃组TNF-α、IL-1β较45℃组明显升高。结论:灸法具有良好的抗炎作用，灸温的高低直接影响治疗疗效，TRPV1在感知灼痛温度(＞43℃)后，参与了艾灸抗炎效应。

灸温;炎症因子;瞬时受体电位香草酸亚型1

近年来研究表明，灸法临床优势病种有34个［1］，与免疫有关的占94%，可见利用灸法进行多种病证的治疗过程中，其抗炎免疫特性发挥着十分重要的作用。影响灸法抗炎免疫特性的因素有很多，灸温是关键因素之一［2-4］，目前尚缺乏灸温高低对灸法疗效影响的量化实验研究。

随着现代分子生物学的发展，躯体及皮肤组织中许多能够感受温度变化的蛋白受体(瞬时受体电位通道，transient receptor Potential，TRP)相继被发现。其中，瞬时受体电位香草酸亚型1(Transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是目前研究最多的TRP家族成员，该通道亚型可被高于43℃热刺激激活，引起细胞外的钙离子内流，从而产生神经信息的传导、肌肉收缩、神经递质释放、细胞分化增殖、基因转录和细胞凋亡等一系列复杂的生物活动。灸法产生的抗炎效应很可能与温度激活TRPV1有关。

45℃是人们首先感受疼痛的平均临界值，也是组织开始被热损伤的温度［5］。本研究将38℃和45℃作为恒温控制条件，探讨不同灸温对佐剂性关节炎大鼠血清炎症因子的影响，同时引入阻断剂辣椒平来进行TRPV1被阻断前后的对比性研究，以期进一步明确TRPV1与灸法抗炎效应的关系，为探讨灸法抗炎疗效的本质提供一些新思路。

1 实验材料

1.1 动物及分组

选用清洁级健康成年雄性SD大鼠40只，体质量(200±20)g，购自南京医科大学实验动物中心(合格证号SCXK(苏)2008-0004)。本实验过程中对动物处理符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。适应性喂养1周，饲养环境为温度20～28℃，相对湿度50% ～70%。将40只SD大鼠随机分出8只作为空白组，其余32只均采用右后足趾皮垫注入弗氏完全佐剂(FCA)制备急性佐剂性关节炎模型，24 h造模成功后再随机分成模型组、38℃艾灸组、45℃艾灸组、CPZ+45℃组，每组各8只。

1.2 药品及仪器

弗式完全佐剂 FCA溶液(10 ml，068K876，Sigma)，特制清艾条(7 mm×200 mm南阳汉医艾绒有限责任公司)，辣椒平Capsazepine(5 mg，C191，Sigma)，吐温80(批号20120319，成都科龙化工试剂厂)，无水乙醇(南京宁试化学试剂有限公司)，生理盐水(批号 e120411c，安徽环球药业股份有限公司)，乌拉坦(上海青析化工科技有限公司)，IL-1β试剂盒(KGERC007，南京凯基生物科技发展有限公司)，TNF-α试剂盒(KGERC102a，南京凯基生物科技发展有限公司)，CT14D台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)，酶标仪(240351，美国BioTek公司)，测温仪(TES1310TYPE-K测温仪，南京中医药大学针药结合实验室提供)。

2 实验方法

2.1 造模方法

采用弗式完全佐剂(FCA)造模法，大鼠右后足趾皮垫下注入0.15 mlFCA溶液。24 h后右后足踝关节明显红肿，提示急性造模成功。配制浓度为0.5%的辣椒平溶液，溶媒成分为吐温80、无水乙醇、生理盐水比例为1∶1∶8。

2.2 治疗方法

选穴“肾俞穴”、“后三里穴”［6］。用自制黑布袋将大鼠俯卧位固定，备皮刀剔除穴位区1 cm2面积的鼠毛暴露出局部皮肤，用记号笔标记穴位定位。空白组注入0.15 ml的生理盐水;模型组同实验组抓取、剃毛，不给予艾灸及药物干预刺激。38℃艾灸组采用雀啄灸(上下移动频率120次/min，艾条距离穴位距离为(30±15)mm，每20 s弹灰1次)，使穴区皮肤温度为(38±1)℃，测温仪探头置于施灸穴区皮肤表面以监测实时温度;45℃艾灸组采用雀啄灸(频率120次/min，艾条距离穴位的距离为10 mm±5 mm，每5 s弹灰1次)，使穴区皮肤温度为(45±1)℃(测温仪监控);辣椒平(CPZ)+45℃组施灸前在穴位局部涂抹0.5%辣椒平溶液，每10 min涂1次共涂3次，30 min后施艾条雀啄灸，灸温控制在(45±1)℃。各治疗组皆灸取双侧“肾俞、后三里”，每穴10 min，每日1次，连续治疗5 d结束后麻醉摘眼球取血。

2.3 观察指标及检测方法

用20%乌拉坦腹腔注射1 g/kg，麻醉约5 min后摘眼球取血4～6 ml。将全血静置2 h，4℃3000 rpm离心15 min，取上清液分装于0.5 ml离心管，置-20℃保存。采用酶联免疫吸附法(ELISA)法检测血清中的肿瘤坏死因子TNF-α、白介素1β浓度。

2.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差(±s)表示，采用完全随机设计的单因素方差分析，组间比较选用LSD法，检验标准取α= 0.05。

3 结果

3.1 温度刺激对大鼠血清TNF-α、IL-1β影响

表1显示，与空白组比较，模型组TNF-α、IL-1β显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，说明弗氏完全佐剂导致大鼠血清呈高炎症反应状态。与模型组比较，45℃艾灸组TNF-α、IL-1β显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明45℃灸温可以明显降低炎症因子水平，具有抗炎作用。与模型组比较，38℃艾灸组TNF-α降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，IL-1β有所降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)，表明38℃灸温降低炎症因子水平有限。

表1 温度刺激对大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响(±s)

注:与空白组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01

组别 鼠数 TNF-α(pg/ml) IL-1β(pg/ml)空 白 组8 12.95±1.22 4.06±0.84模 型 组 8 78.96±4.751) 45.37±3.431)3 8℃ 艾灸组 8 74.72±4.302) 43.55±2.85 4 5℃ 艾灸组 8 46.98±2.183) 32.98±3.813)

3.2 不同灸温及药物干预对大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响

表2显示，与38℃艾灸组比较，45℃艾灸组TNF-α、IL-1β明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明45℃灸温抗炎作用优于38℃。与45℃艾灸组比较，CPZ+45℃组TNF-α、IL-1β明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明辣椒平阻断了45℃灸温抑制炎症因子的效应。

4 讨论

本实验结果表明，艾灸可降低佐剂性关节炎大鼠血清中的TNF-α、IL-1β水平，具有抗炎作用，较高的灼痛感45℃治疗作用明显优于较低的温和感38℃，说明温度的高低直接影响艾灸抗炎疗效。在人体可接受的温度范围内，提高灸温即可提高艾灸疗效。

表2 不同灸温及药物干预对大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响(±s)

表2 不同灸温及药物干预对大鼠血清TNF-α、IL-1β的影响(±s)

注:与38℃艾灸组比较:1)P＜0.01;与45℃艾灸组比较:2)P＜0.01

组别 鼠数 TNF-α(pg/ml) IL-1β(pg/ml) 3 8℃艾灸组8 74.72±4.30 43.55±2.85 4 5℃艾灸组 8 46.98±2.181) 32.98±3.811)CPZ+45℃组 8 75.28±4.192) 48.56±3.752)

TRPV1广泛分布于感受伤害性信息的神经末梢及鼻黏膜、呼吸道、肺、胃黏膜、皮肤等非神经组织［7］。目前认为，TRPV1可引起细胞外的钙离子内流，在炎性痛、内脏痛及痛觉敏化中均发挥着重要作用［8］。辣椒平是最早发现可以阻断TRPV1的拮抗剂，其抑制钙离子内流的IC50为0.65 mmol/L［9］。本实验通过CPZ+45℃组与45℃艾灸组的抗炎效应比较，前者TNF-α、IL-1β水平皆高于后者，说明经辣椒平预处理后艾灸的抗炎疗效减弱。据此可推测，在艾灸治疗炎症的过程中，TRPV1激活与否影响了治疗疗效，即TRPV1参与了45℃灸温的抗炎效应。

TRPV1可被辣椒素、H+、热和机械刺激等多种理化因素激活［10-11］，其中热刺激温度达到43℃方可被激活，这也是上述“较高的灼痛感45℃治疗作用明显优于较低的温和感38℃”的原因。实验结果指导临床，人体可接受的灼痛感温度为 40.9～46℃［12］。采用麦粒灸疗法［13］，通过对艾粒大小、壮数多少、质地松紧及移走快慢等进行精细控制，即可获得这种灼痛感的温度。目前临床广为运用的是温和灸，也可通过改变操作技巧达到如麦粒灸穿透样的灼痛感温度。临床患有肝炎、中风、肿瘤、强直性脊柱炎等难治性疾病的患者，应权衡疗效与灼痛的利弊，坚持数年灼痛感的灸疗后，方可提高机体免疫力，改善免疫紊乱，缓解不适症状。因此，适度的灼痛感灸疗值得在临床推广，以发挥艾灸这一古老疗法的作用潜能。

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Research of Anti-inflammatory Effect About Different Moxibustion Temperatures and TRPV1 Functional Mechanism

ZHOU Pan，ZHANG Jian-bin，WANG Ling-ling△，JI Hui，XIE Bo
(Laboratory of Integrated Acupuncture and Medicine，Nanjing University of traditional Chinese Medicine，Nanjing 210029，China)

Objective:To explore the influence of different moxibustion temperatures on adjuvant arthritis rats serum inflammatory cytokines and transient receptor potential vanilloid 1 TRPV1 mechanism.Method:The 40 SD rats were randomly divided into a blank group，a model group，38℃ moxibustion group，45℃ moxibustion group and CPZ+45℃group.Using the freund′s complete adjuvant(FCA)established the model of adjuvant arthritis(AA)rats.Moxibustion was applied at the last three groups at“Shenshu”(BL23)and“Housanli”(ST36)for 10 min per acupoint per day，at the same time controlling the temperature at(38±1)℃ or(45±1)℃.CPZ+45℃ group daubed the TRPV1 blocker CPZ solution at acupoints，daubing once every 10 minutes，after thirty minutes moxibustion was applied controlling the temperature at (45±1)℃ simultaneously.After continuous five days treatment，serum was acquired.Enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA)method was adapted to measure the concentration of tumor necrosis factor TNF-α and interleukin IL-1β. Results:The TNF-α and IL-1β in the model group were significantly higher than those in the blank group.The TNF-α of the 38℃ group was lower than model group，but the comparison of IL-1β without statistical significance，those of 45℃ group were lower than those of model group.The TNF-α and IL-1β of the 45℃ group were significantly lower than those of the 38℃ group.The TNF-α and IL-1β of the CPZ+45℃ group were significantly higher than those of the 45℃ group. Conclusion:Moxibustion has good anti-inflammatory effects，The temperature of high and low directly affects treatment efficacy，TRPV1 in perception of hot temperature above 43℃ participates in the anti-inflammatory effect of moxibustion.

Moxibustion temperature;Inflammatory cytokines;Transient receptor potential vanilloid 1

R245.81

:B

:1006-3250(2015)09-1143-03

2015-03-18

江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(CXLX13_ 58);国家自然科学基金资助项目(81373750);国家重点基础研究发展计划(973)项目(2009CB522905)

周 攀(1987-)，女，医学硕士，从事针灸的临床与研究。

△通讯作者:王玲玲(1949-)，女，教授，博士研究生导师，从事针药结合临床与神经内分泌机制研究，E-mail:wanglingl@ gmail.com。