不同灸法对类风湿关节炎家兔HPAA功能的影响❋

高秀花，王兴丽，刘旭光△，贾 敏，黎海军

(1.成都中医药大学，成都 610075;2.山西省针灸研究所，太原 030006)

不同灸法对类风湿关节炎家兔HPAA功能的影响❋

高秀花1，王兴丽2，刘旭光1△，贾 敏1，黎海军1

(1.成都中医药大学，成都 610075;2.山西省针灸研究所，太原 030006)

目的:观察不同灸法对类风湿关节炎(RA)模型的抗炎效应，探索其对实验性RA下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPAA)功能的影响。方法:采用弗氏完全佐剂法造模，将家兔按随机数字表法分为空白组、模型组、直接灸组、隔姜灸组及温和灸组。于造模前及治疗后第7、14、21天测量各组膝关节周长，用ELISA法检测各组血清中促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CS)含量。结果:各艾灸组膝关节周长明显低于模型组;其中隔姜灸组下降幅度最大，但差异无统计学意义;相比模型组，各艾灸组CRF、CS含量明显降低，ACTH明显升高;各艾灸组间比较差异无统计学意义。结论:不同灸法对实验性RA均有明显的抗炎作用，隔姜灸可能有更好的作用趋势;不同灸法对HPAA功能均有明显的调整作用，这可能是艾灸抗炎效应的重要机制之一，但不同灸法比较差异无统计学意义。

不同灸法;类风湿关节炎;下丘脑-垂体-肾上腺轴;CRF;ACTH;CS

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以对称性多关节炎表现为主的慢性、全身性自身免疫性难治性疾病，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(Hypothalamic Pituit Aryadvenal Axis，HPAA)功能紊乱在RA的发生发展中具有重要作用。类风湿关节炎属于中医学“痹症”范畴，因RA病情顽固、久延难愈且疼痛遍历周身多个关节，有别于一般的“痹症”，故又属于痹症之“历节风”、“鹤膝风”、“鼓槌风”、“顽痹”、“尪痹”等范畴。

大量研究证实，艾灸治疗RA具有确切的抗炎效应，HPAA轴作为一条重要的神经体液性调节途径在其中发挥重要作用。艾灸治疗RA方法多样，大体可分为直接灸、温和灸和隔物灸三大类，温热刺激是其共同的、主要的作用形式，而不同灸法具有不同的温热刺激模式，在治疗RA中是否存在抗炎效应差异，不同灸法对实验性RA HPAA功能是否具有不同的影响，目前尚未见相关报道。在前期研究的基础上，我们从艾灸治疗RA的抗炎效应出发，以HPAA为切入点，以“艾灸温热刺激-HPAA功能-抗炎效应”为研究主线，观察比较直接灸、隔姜灸、温和灸治疗实验性RA的抗炎效应，探索不同灸法对实验性RA家兔HPAA功能的影响，以期更深入地揭示艾灸治疗RA的作用原理。

1 材料

1.1 动物

日本大耳兔(动物及饲料由成都中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号2008-14)40只，雌雄各半，体质量(2.5±0.25)kg，实验过程中对动物的处置符合相关动物伦理学要求。

1.2 主要试剂及仪器

弗氏完全佐剂(FCA，美国Sigma公司生产，货号Lot071M8715，内含0.1%灭活结核杆菌，购于上海生工公司成都分公司);生理盐水(四川科伦药业股份有限公司生产，批号B12021911);艾炷(中国南阳市东升艾灸厂生产，批号 120403，艾条规格: 18mm×200mm，自制成4mm×10mm/壮的艾炷);家兔CRF(Corticotrophin releasing factor促肾上腺皮质激素释放因子)、ACTH(adrenocorticotropic hormone促肾上腺皮质激素)、CS(corticosterone皮质酮) ELISA试剂盒(购于上海文乐生物科技有限公司，货号分别为E71018、E71026、E71031);自动平衡离心机(LD25-2，北京医用离心机厂);酶联免疫检测仪(DG3022，国营华东电子管厂);孵育箱(SN600147-205，USA);洗板机(4MK2，Japan)。

2 方法

2.1 动物分组与模型制备

适应性驯养1周后，按随机数字表将家兔分为空白对照组(简称“空白组”)、RA模型组(简称“模型组”)、温和灸治疗组(简称“温和灸组”)、直接灸治疗组(简称“直接灸组”)、隔姜灸治疗组(简称“隔姜灸组”)5组，每组各8只。

选用RA经典动物模型［1］，驯养1周后，将模型组、各艾灸组家兔双后膝关节周围剃毛暴露，用10%异丙醇消毒皮肤，轻度弯曲膝关节，以膝关节髌骨下缘、髌韧带外侧凹陷为穿刺点，将FCA按0.5 ml/kg体质量剂量平均注入兔双后膝关节腔内;对照组家兔同法注入无菌生理盐水作为对照。

2.2 治疗

于造模后第7天，将各艾灸组家兔分别固定在兔架上，暴露背部及膝关节施灸部位(剃毛约2 cm ×2 cm)，参照《实验针灸学》［2］的动物穴位图谱，使用艾炷(4 mm×10 mm)分别直接灸(艾炷底部涂抹少许凡士林固定艾炷)、隔姜灸(姜片厚度约1 mm，大小为2.5 cm×2.5 cm)、温和灸(距离皮肤约5 mm)家兔“肾俞”、“足三里”穴。每穴连续施灸5壮，左右交替每日1次，6 d为1个疗程，疗程间休息1 d，共治疗3个疗程。对照组和模型组家兔同法抓取、固定，但不予灸。3组同步治疗，均在上午9∶00～11∶00之间进行。

2.3 膝关节周长测定

使用软皮尺过膝关节髌骨下缘、髌韧带外侧凹陷的穿刺点，于造模前及治疗第7、14、21天分别测定各组家兔左右后肢的膝关节周长。

2.4 取样

治疗第21天上午9∶00～11∶00间，经耳缘静脉取血5 ml并注射空气处死各组家兔，于离心管内静置1 h，经离心后取上清液放入Eppendorf管，用记号笔标号，-20℃冰箱保存待测。按照试剂盒说明书操作，用 ELISA双抗夹心法检测血清中 CRF、ACTH、CS含量。

3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，统计资料以均数±标准差(±s)表示，各组数据经过正态检验和方差齐性检验后，组间比较用单因素方差分析，方差齐时选用LSD(Least Significant Differece，最小显著差异法)，方差不齐时选用Tamhane’s T2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 不同灸法对实验性RA家兔膝关节周长的影响

表1、2显示，造模前各组家兔左、右膝关节周长比较差异无统计学意义;与空白组比较，造模后各个时间点模型组家兔左、右膝关节周长均显著升高(P＜0.01);与模型组比较，治疗第7、14、21天各艾灸组家兔左、右膝关节周长均明显降低(P＜0.01);3个治疗组之间比较，在治疗第14、21天隔姜灸组左、右膝关节周长下降幅度较大，但与温和灸组、直接灸组比较差异无统计学意义。

表1 各组家兔左膝关节周长比较(±s)

表1 各组家兔左膝关节周长比较(±s)

注:与空白组比较:△△P＜0.01;与模型组比较:＊＊P＜0.01

组别 家兔数 造模前(cm) 治疗后第7天(cm) 治疗后第14天(cm) 治疗后第21天(cm)空 白 组 8 10.68±0.30 10.83±0.21 10.75±0.27 10.70±0.28模 型 组 8 10.57±0.22 12.66±0.31△△ 12.37±0.42△△ 12.02±0.34△△温 和 灸 组 8 10.72±0.35 12.13±0.29＊＊ 11.83±0.3＊＊ 11.31±0.21＊＊直 接 灸 组 8 10.61±0.30 12.16±0.21＊＊ 11.72±0.27＊＊ 11.39±0.21＊＊隔 姜 灸 组 8 10.66±0.30 12.16±0.14＊＊ 11.71±0.37＊＊ 11.19±0.40＊＊

4.2 不同灸法对实验性RA家兔HPAA功能的影响

表3显示，与空白组比较，模型组CRF、CS含量显著升高(P＜0.01)，ACTH含量显著降低(P＜ 0.01);与模型组比较，温和灸组、直接灸组和隔姜灸组CRF、CS含量均显著降低(P＜0.01)，ACTH含量均显著升高(P＜0.01);3个治疗组比较差异无统计学意义。

表2 各组家兔右膝关节周长比较(±s)

表2 各组家兔右膝关节周长比较(±s)

注:与空白组比较:△△P＜0.01;与模型组比较:＊＊P＜0.01

组别 家兔数 造模前(cm) 治疗后第7天(cm) 治疗后第14天(cm) 治疗后第21天(cm)空 白 组 8 10.74±0.24 10.82±0.16 10.78±0.20 10.65±0.31模 型 组 8 10.56±0.24 12.63±0.36△△ 12.39±0.40△△ 12.04±0.18△△温 和 灸 组 8 10.70±0.35 12.13±0.30＊＊ 11.83±0.32＊＊ 11.38±0.17＊＊直 接 灸 组 8 10.61±0.30 12.10±0.20＊＊ 11.80±0.22＊＊ 11.32±0.39＊＊隔 姜 灸 组 8 10.73±0.35 12.14±0.15＊＊ 11.73±0.22＊＊ 11.19±0.48＊＊

表3 各组家兔血清中CRF、ACTH、CS含量比较(±s)

表3 各组家兔血清中CRF、ACTH、CS含量比较(±s)

注:与空白对照组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:△△P＜0.01

组别 家兔数(只) CRF(pg/ml) ACTH(pg/ml) CS(pg/ml)空 白 组813.23± 2.92 248.95±49.89 42.39± 0.79模 型 组 8 195.88±22.37＊＊ 45.66± 9.69＊＊ 172.21±28.80＊＊温 和 灸 组 8 112.37±24.28△△ 180.15±39.57△△ 68.95±17.79△△直 接 灸 组 8 127.84±40.42△△ 173.78±53.81△△ 70.37±23.94△△隔 姜 灸 组 8 100.67±35.47△△ 142.18±38.19△△ 70.34±12.56△△

5 讨论

RA是以对称性多关节炎为主要临床表现的系统性、自身免疫性疾病，其病因及发病机制尚未明确［3］，滑膜炎症反应是RA的主要病理变化，主要症状为局部的红、肿、热、痛。因此，本实验从宏观角度选择测量家兔的膝关节周长以判断炎症反应的程度。根据实验结果本研究造模成功，模型组炎症反应持续存在，3种灸法均有明显的抗炎、消肿作用，虽3组间差异无统计学意义，但隔姜灸可能有更好的作用趋势，与文献报道相近［4］。

近年来，随着神经内分泌学的进展，HPAA在RA发病机制中的作用越来越受到重视［5］。HPAA功能紊乱，机体内分泌-神经-免疫系统将发生异常。HPAA主要的调节物质分别是由肾上腺、垂体、下丘脑分泌的GC(glucocorticoid糖皮质激素)、ACTH、CRH(corticotropin releasing hormone促肾上腺皮质激素释放激素)组成。GC是体内首要的抗炎物质，与ACTH、CRH三者间互相影响，通过复杂的正、负反馈调节构成完整的HPAA［6］。因此，调整HPAA功能，纠正其紊乱状态，最终实现控制RA的炎症反应，将成为治疗RA的新的有效方法。

RA属于中医“痹症”范畴，其主要病机为本虚标实，中医治疗RA多从肾论治［7］。《灵枢·官能》中的“针所不为，灸之所宜”高度评价了灸法这一传统疗法，灸法可补针药之不足，善于温经通络、散寒止痛、行气活血、扶阳固脱、补肾固本、升阳举陷等［8］，尤其在虚、寒类疾病治疗中具有独特优势，合以“肾俞”、“足三里”两穴，共奏温肾健脾、补益气血治本、活血化瘀、疏通经络治标之效。

已有相关研究［9-10］证实，艾灸治疗RA能够通过有效调整HPAA功能来发挥确切的抗炎效应。因此，本实验重点观察具有不同温热刺激模式的不同灸法对实验性RA HPAA功能是否具有不同的影响。本实验研究发现，模型组血清CRF、CS含量显著高于空白组，ACTH含量则显著降低，提示RA模型中存在HPAA功能紊乱;治疗后各艾灸组CRF、 CS含量明显低于模型组，ACTH含量则明显升高，提示不同灸法治疗实验性 RA均可能通过调整HPAA功能，从而发挥明显的抗炎效应;各艾灸组间CRF、ACTH、CS含量比较差异无统计学意义，提示不同灸法对实验性RA HPAA功能的调整作用差异无统计学意义。

综上我们认为，不同灸法治疗实验性RA均有明显的抗炎效应，隔姜灸可能有更好的作用趋势;不同灸法对实验性RA HPAA功能均有明显的调整作用，这可能是艾灸发挥抗炎效应的重要机制之一。虽然本研究发现不同灸法对实验性 RA家兔的HPAA功能调整作用无明显差异，但不排除不同灸法可能会不同程度地诱导热休克蛋白(HSP)等相关分子表达，从而发挥不同的治疗作用，故需要在今后的研究中进一步探索。

［1］陈奇.中药药理实验方法学［M］.北京:人民卫生出版社，1994:68.

［2］郭义.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2008:402.

［3］Firestein GS.Evolving concepts of rheumatoid arthritis［J］. Nature，2003，423(6937):356-361.

［4］杨涵棋，刘旭光，张耀，等.不同灸法对实验性RA模型IL-6、IL-8、MCP-1表达影响的研究［J］.中华中医药学刊，2012，30(12):2625-2627.

［5］汪亚东，向月应.类风湿关节炎患者下丘脑-垂体-肾上腺轴功能检测及其意义［J］.国外医学·临床生物化学与检验学分册，1997，18(3):108-110.

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［10］高骏，刘旭光，周海燕，等.从RA大鼠夜间ACTH、CS水平探讨艾灸抗炎效应的HPAA昼夜节律基础［J］.中国中医基础医学杂志，2010，16(6):515-523.

Effects of Different Moxibustion on the Function of HPAA in Rabbits with Rheumatoid Arthritis

GAO Xiu-hua1，WANG Xing-li2，LIU Xu-guang1△，JIA Min1，LI Hai-jun1
(1．Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China;2．Shanxi Institute of acupuncture，Taiyuan 030006，China)

Objective:To observe the anti-inflammatory effect of different moxibustion on rheumatoid arthritis(RA) models，to explore their effects on the hypothalamus-pituitary-adrenal cortical axis(HPAA)function.Method:The RA animal model was established by Freund′s complete adjuvant method.Japanese rabbits were randomized to blank-control group，RA model group，direct moxibustion group，ginger moxibustion group or mild moxibustion group.Before model building and on the 7th，14th，21st day after treatment，to measure each rabbit back-knee circumference by a tape measure，to detect the content of ACTH，CRF and CS in the rabbit serum by ELISA.Results:(1)Compared with the model group，all moxibustion treatments could remarkably decrease the knee circumference，the circumference’s decline magnitude of the ginger moxibustion group is largest among them，but there are no statistical significance.(2)Compared with the model group，all moxibustion treatments could remarkably decrease CRF、CS content and increase ACTH content，but their content have no significant difference among three moxibustion groups.Conclusion:All moxibustion treatments have significant anti-inflammatory effects on RA models，ginger moxibustion may have a better trend of effect among them; All moxibustion treatments can adjust HPAA functions obviously.So，adjusting HPAA functions may be one of the important mechanisms of moxibustion’s anti-inflammatory effect，however，there are no significant difference in the expression of HPAA in different moxibustion methods.

Different Moxibustion;RA;HPAA;CRF;ACTH;CS

R593.22

:A

:1006-3250(2015)09-1140-03

2015-03-14

国家自然科学基金资助项目(81173319)-不同灸法治疗RA的抗炎效应及其HSP70分子调控机制研究

高秀花(1989-)，女，山西忻州人，医学硕士，从事针灸治疗类风湿关节炎的基础研究。

△通讯作者:刘旭光(1965-)，男，四川资中人，研究员，博士研究生导师，从事针灸调整神经-内分泌-免疫疾病的基础研究，Tel:13208181517，E-mail:lxg418@126.com。