临床三种常规粪便隐血实验的方法学评估

杨勇文，李从荣，李 艳，袁乐永

(武汉大学人民医院检验医学中心，湖北 武汉 430000)

临床三种常规粪便隐血实验的方法学评估

杨勇文，李从荣，李 艳，袁乐永

(武汉大学人民医院检验医学中心，湖北 武汉 430000)

目的 对匹拉米洞法、血红蛋白单克隆抗体法(单克隆抗体法)和转铁蛋白(Tf)/血红蛋白(Hb)联合免疫法(联合免疫法)进行性能评估。方法通过300例临床样本和不同的动物血红蛋白(Hb)、维生素C(VitC)进行检测，从灵敏度、干扰性实验、反应时间等检测指标来反映三种方法的检验效能。结果匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法检测Hb最低浓度分别为2.5µg/ml、0.1µg/ml、0.1µg/ml，联合免疫法检测Tf的最低浓度为0.05µg/ml。匹拉米洞法可以和人以及不同动物的血红蛋白反应，单克隆抗体法和联合免疫法只对人的血红蛋白反应；Vit C不会对单克隆抗体法和联合免疫法产生影响，一定的Vit C会使匹拉米洞法产生假阴性结果。三种方法的反应时间分别为17 s、26 s、24 s。匹拉米洞法检测上消化道隐血组、下消化道隐血组和对照组的阳性率分别为95.1%、73.7%、10.8%；单克隆抗体法分别为74.4%、94.7%、2.5%；联合免疫法分别为90.2%、100%、6.7%。结论匹拉米洞法、单克隆抗体法、联合免疫法对不同部位的消化道隐血的检测相辅相成，各具特点。三种方法联合检测对消化道疾病的辅助诊断具有重要的意义。

粪便隐血；联合免疫；单克隆抗体；匹拉米洞

隐血是指消化道少量出血，红细胞被消化破坏，粪便外观改变无异常，肉眼和显微镜均不能证实的出血。粪便隐血实验(Fecal occult blood test，FOBT)对消化道出血的诊断具有重要价值，是目前慢性消化出血性疾病、早期发现和诊断消化道恶性肿瘤的一个筛查指标。化学法和免疫法是目前临床上较常用的两类方法，本研究采用的化学法是匹拉米洞法，免疫法则包括血红蛋白单克隆抗体法(单克隆抗体法)和转铁蛋白(Tf)/血红蛋白(Hb)联合免疫法(联合免疫法)。化学法灵敏度适中，但易受药物、动物血等因素影响，而免疫法具有高灵敏度、高特异性的特点，但在方法学和其他方面的缺陷导致实际临床运用过程中出现一些不足[1]。因此新出现的免疫法并不能完全取代传统的化学法。本研究通过对匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法进行初步性能评估，探讨该三种方法的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年8月至2014年9月武汉大学人民医院300例住院患者粪便样本，其中120例为临床确诊消化道隐血患者的粪便样本(包括82例为上消化道隐血样本，38例为下消化道隐血样本)，180例为常规粪便样本(临床未诊断有任何消化道疾病的样本)。

1.2 试剂与方法 匹拉米洞法采用珠海贝索公司提供的贝索粪便隐血Ⅱ号试纸(FeceOB-II)，单克隆抗体法采用万华普曼生物工程有限公司提供的单克隆抗体试剂盒。联合免疫法采用万华普曼生物工程有限公司提供的联合免疫法试纸。将上消化道隐血样本、下消化道隐血样本和临床未诊断有任何消化道疾病的样本分别设定为上消化道隐血组，下消化道隐血组和对照组。采用匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法分别对这三组标本进行平行检测。操作和结果判读按照各自的说明书进行。

1.3 灵敏度实验 取已知Hb浓度的人全血质控品，用蒸馏水稀释成含Hb 2 000µg/ml、1 000µg/ml、500µg/ml、250µg/ml、125µg/ml、100µg/ml、75µg/ml、50µg/ml、25µg/ml、10µg/ml、5µg/ml、2µg/ml、1µg/ml、0.5µg/ml、0.2µg/ml、0.1µg/ml 16种浓度的Hb混悬液，用上述三种方法分别测定；取已知浓度的Tf，用蒸馏水稀释成2µg/ml、1µg/ml、0.4µg/ml、0.1µg/ml、0.05µg/ml、0.04µg/ml、0.02µg/ml 7种浓度的转铁蛋白悬液，用联合免疫法测定。

1.4 抗干扰实验 在含Hb 500µg/ml与250µg/ml的大便混悬液中分别加入50mg/ml、25mg/ml、20mg/ml、10 mg/ml、7.5 mg/ml、5 mg/ml 6种不同浓度的Vit C；收集鸽、鸡、鸭、猪、兔、狗6种动物全血，分别制成1 000µg/ml、500µg/ml、200µg/ml、20 ug/ml、12µg/ml、6µg/ml、0.2µg/ml、0.1µg/m l8种Hb混悬液。用上述三种方法测定。

1.5 反应时间 从3种试剂中随机抽取10份，分别测同一份约含Hb 3.5µg/ml的粪便样本。匹拉米洞法以滴加显色剂(3%过氧化氢)后计时，单克隆抗体法、联合免疫法以加样区开始接触样本后开始计时，待液体渗透至控制线并且出现肉眼可见的颜色后记录终末反应时间。取三种方法分别测试10份标本后的平均时间作为各自的反应时间。

1.6 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种方法检测人全血Hb灵敏度的比较 单克隆抗体法和联合免疫法的检测灵敏度高(0.1µg/ml)；Hb浓度在250～500µg/ml内反应较强，结果容易判断；Hb浓度＞1 000µg/ml，反应结果不易判断。匹拉米洞法灵敏度为2.5µg/ml，见表1。

2.2 干扰性实验

2.2.1 不同动物的不同浓度Hb对三种方法检测结果的比较 匹拉米洞法试剂可以与不同动物Hb发生反应，检测Hb的最低浓度为2.5µg/ml；单克隆抗体法和联合免疫法试剂不与各种动物Hb反应。

2.2.2 不同Vit C浓度对三种检测方法结果的影响 单克隆抗体法和联合免疫法不受任何浓度Vit C影响；当Hb浓度为0.25 mg/ml，Vit C浓度＞5 mg/ml时，匹拉米洞法结果为阴性；当Hb浓度为0.5 mg/ml时，Vit C浓度＞7.5 mg/ml时，匹拉米洞法结果为阴性，见表2。

表1 三种隐血试验法检测人全血Hb灵敏度的比较

表2 VitC对三种大便隐血实验结果的影响

2.3 三种检测方法检测反应时间比较 匹拉米洞法，单克隆抗体法和联合免疫法的反应时间分别为17 s、26 s、24 s。

2.4 三种隐血实验阳性率比较 上消化道隐血组中，匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法的阳性率分别为95.1%、74.4%、90.2%；匹拉米洞法和单克隆抗体法差异有统计学意义(χ2=13.639，P＜0.05)，单克隆抗体法和联合免疫法差异有统计学意义(χ2= 7.079，P＜0.05)；下消化道隐血组中，匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法的阳性率分别为73.7%、94.7%、100%；，匹拉米洞法和联合免疫法差异有统计学意义(χ2=11.515，P＜0.05)，单克隆抗体法和联合免疫法差异有统计学意义(χ2=6.333，P＜0.05)。对照组匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法检测的阳性率10.8%、2.5%、6.7%，匹拉米洞法和单克隆抗体法差异有统计学意义(χ2=6.696，P＜0.05)。

3 讨论

近年来，随着国人的生活方式不断西化和饮食习惯的改变，消化系统疾病特别是结直肠癌的发病率逐年上升；粪便隐血实验是作为常规筛查手段，能够较早的发现消化系统疾病的相关临床症状，有效的降低其患病率和死亡率[2-3]。

匹拉米洞法利用血红蛋白中的亚铁血红素所具有的过氧化物酶活性，催化过氧化氢，放出新生态氧，将受体试剂氧化变色，并且颜色的深浅与隐血的含量成正比关系[4]。一方面，在患者就诊前，如果服用大量的VitC或者其他具有还原性物质，将还原过氧化氢而出现假阴性结果；另一方面，匹拉米洞法常因食物或药物中亚铁离子的影响出现假阳性。匹拉米洞法检测具有敏感度适中、显色反应稳定、价格低廉等优点[5]。免疫法的检测原理为双抗体夹心法即：通过特异的人Hb或Tf单克隆抗体包被纤维素薄膜，与粪便中人的Hb或Tf特异地结合，再利用胶体金标记的抗人Hb或Tf抗体进行显色反应[6]。免疫法具有较高的特异性和敏感性，所需的样本量比匹拉米洞法更少并且没有饮食和药物上的限制[7]。但是，免疫法在方法学存在缺陷即：如果抗原或抗体过量以及血红蛋白分子发生变性时，单克隆抗体法将出现假阴性结果；而联合免疫法结合了转铁蛋白的稳定性，能够避免单克隆抗体法的部分缺陷(血红蛋白分子发生变性时也可以检出)，是检测消化道出现隐血较为理想的方法[8]。

在三种隐血试验法检测人全血Hb灵敏度的比较中，我们发现单克隆抗体法和联合免疫法检测的灵敏度(0.1µg/ml)比匹拉米洞法灵敏度高(2µg/ml)，因此，免疫法适合检测消化道微量出血。本研究发现免疫法主要存在的问题是假阴性。对于单克隆抗体法而言，如果血红蛋白在胃部珠蛋白链被酸迅速水解或者在小肠被蛋白酶降解，血红蛋白可能被充分降解或消失殆尽而失去单克隆抗体所特异结合的抗原决定簇；在体外或胃肠道内细菌的作用也可使粪便中的血红蛋白免疫活性丧失[9]，此时检测结果为阴性。而转铁蛋白在消化道中的性质非常稳定，联合免疫法能够检测微量的转铁蛋白(0.05µg/ml)来弥补单克隆抗体法的不足。当然，如果患者并发遗传性Tf缺乏症、尿毒症、风湿性关节炎等疾病时，导致Tf含量较低，联合免疫法也出现假阴性结果，此时应参考单克隆抗体法的结果进行判断。当Hb浓度(＞1 000µg/ml)过高，单克隆抗体法和联合免疫法的检测结果均为阴性(这是因为抗原过多出现的后带现象)[10]。此时应该参考可以检测出高浓度Hb的匹拉米洞法。总之，免疫法的高敏感性对消化道疾病早期的微量出血具有独特的预报作用，但是免疫法因消化道出血量大而出现假阴性时，应参考匹拉米洞法结果判断。

从干扰性实验的结果分析来看，不同动物的不同浓度Hb达到2.5µg/ml浓度时，都会对匹拉米洞法造成干扰，产生假阳性结果。正常人24 h生理性失血量约为0.6 ml，三种方法都可能会出现假阳性结果，值得临床工作者注意。匹拉米洞法检测出的动物血的血红蛋白浓度与人的血红蛋白浓度基本上一致，因此匹拉米洞法检测血红蛋白的种属特异性差。Vit C对匹拉米洞法有很强的干扰作用[11]。免疫法对Hb和VitC都不反应，免疫法的特异性和抗干扰能力强[8]。此外，匹拉米洞法的反应时间比免疫法短。

匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法检测上消化道出血组的阳性率分别为95.1%、74.4%、90.2%；匹拉米洞法、联合免疫法与单克隆抗体法阳性率的差异有统计学意义(P＜0.05)，说明匹拉米洞法和联合免疫法相对于单克隆抗体法来说，匹拉米洞法和联合免疫法在检测上消化道隐血更具优势。在下消化道出血组中，匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法的阳性率分别为73.7%、94.7%、100%；联合免疫法、单克隆抗体法和匹拉米洞法的阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)，说明单克隆抗体法和联合免疫法相对于匹拉米洞法来说，单克隆抗体法和联合免疫法更适合下消化道隐血的辅助诊断。在对照组中，匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法检测的阳性率分别为10.1%、2.7%、6.5%，匹拉米洞法与单克隆抗体法阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)，说明匹拉米洞法假阳性率相对较高。因此，我们应该充分利用联合免疫法的敏感度和特异度，来减少匹拉米洞法的假阳性和单克隆抗体法的假阴性。

综上所述，匹拉米洞法简便、易于操作、敏感性适中(2.5µg/ml)、特异度相对较差且容易被各种因素干扰。单克隆抗体法和联合免疫法的敏感度高，可以检测出0.1µg/ml的血红蛋白浓度；特异性强，可以直接检测出人的Hb。免疫法被世界卫生组织和世界胃肠镜检查协会推荐作为粪便隐血试验的一种较为确认的方法[12]。在临床工作中我们建议同时应用匹拉米洞法、单克隆抗体法和联合免疫法法。当三种方法出现不同情况的矛盾结果时，我们应该相互结合它们的优缺点以及其他检测指标，进行综合判断。

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Assessment of three kinds of routine detection methods for occult blood test.

YANG Yong-wen,LI Cong-rong,LI Yan, YUAN Le-yong.Center of Laboratory Medicine,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430000,Hubei,CHINA

Objective To evaluate the performance of pyramidon chemical method,hemoglobin monoclonal antibody(monoclonal antibody)and transferring(Tf)/hemoglobin(Hb)combined immunoassay(combined immunoassay).MethodsBased on detection of 300 clinical specimens,Hb and vitamin C of different animals,the performances of the three kinds of methods were assessed by indicators of sensitivity,interference experiment,and reaction time.ResultsThe lowest detected concentration of Hb for pyramidon chemical method,monoclonal antibody and combined immunoassay was 2.5 μg/ml,0.1 μg/ml,0.1 μg/ml,respectively.The lowest detected concentration of combined immunoassay for Tf was 0.05 μg/ml.Monoclonal antibody and combined immunoassay only responsed to human hemoglobin,but pyramidon chemical method could react with hemoglobin and other common animals.Vit C did not affect monoclonal antibody and combined immunoassay,but it would make certain pyramidon assay to produce false negative results.The reaction time of the three methods were 17 s,26 s,24 s,respectively.The positive rate for the detection of upper gastrointestinal hemorrhage group,lower gastrointestinal hemorrhage group,the normal group were 95.1%,73.7%,10.8%by pyramidon chemical method,74.4%,94.7%,2.5%by monoclonal antibody,and 90.2%, 100%,6.7%by combined immunoassay.ConclusionPyramidon assay,monoclonal antibody assay,combined immunoassay has its own advantages for the detection of different parts of the digestive tract hemorrhage.Combined detection of the three methods for auxiliary diagnosis of digestive tract diseases has important significance.

Fecal occult blood;Combined immunoassay;Monoclonal antibody;Pyramidon

R446.13+3

A

1003—6350（2015）07—0998—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0356

2014-10-16)

国家临床重点专科（编号：2010305）

杨勇文。E-mail：yangyongwen1991@163.com