Ⅱ型糖尿病大鼠白内障的ERK通路介导机制及其抑制剂PD98059的改善作用

肖 涵，刘文斌，万 丽

(南京明基医院眼科，江苏 南京 210019)

Ⅱ型糖尿病大鼠白内障的ERK通路介导机制及其抑制剂PD98059的改善作用

肖 涵，刘文斌，万 丽

(南京明基医院眼科，江苏 南京 210019)

目的 分析ERK通路在Ⅱ型糖尿病大鼠白内障发生中的参与机制及PD98059的改善作用。方法35只SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组、PD98059低剂量、中剂量和高剂量组(每组7只)。小剂量STZ联合高糖高脂饮食120 d复制糖尿病大鼠白内障模型，第64天每天对各组大鼠尾静脉注射生理盐水或PD98059。分析各组大鼠晶状体状态及胰岛素抵抗系数HOMA-IR的变化，Real-time PCR和Western blotting分析晶状体中ERK通路相关蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、p38及内质网应激蛋白ATF6、PERK的表达变化。结果与对照组大鼠比较，糖尿病组大鼠晶状体明显浑浊，HOMA-IR明显增高，晶状体组织中p-ERK1/2、p38、PERK和ATF6表达上调，而总ERK的表达未发生变化。PD8059可以显著改善上述晶状体及相关蛋白表达的异常，且具有剂量依从性。结论激活的ERK信号通路参与了Ⅱ型糖尿病大鼠白内障发病过程，PD95059通过抑制上调表达的p38-pERK1/2及内质网应激起缓解作用。

Ⅱ型糖尿病；白内障；ERK通路；PD98059

现代社会生产和生活方式的改变引起糖尿病的发病率和死亡率逐年升高[1]。糖尿病白内障是糖尿病并发症中仅次于糖尿病视网膜病变的第二大眼病，严重影响患者的视力[2]。糖尿病白内障多发生于病情严重的幼年型糖尿病患者，具有发病迅速的特点。糖尿病白内障患者双眼可能在数天或数周内完全浑浊。白内障的发生与维生素和微量元素的缺乏、紫外线影响以及缺氧等相关。但是，高糖或胰岛素抵抗是糖尿病白内障发病的重要因素之一[3]。

ERK1/2(Extracellular signal-regulated kinase)通路是细胞外信号从细胞表面向细胞内传导的重要媒介，活化的ERK1/2蛋白进入细胞核后促进环腺苷酸应答元件结合蛋白(cAMP response binding protein，CREB)等重要的细胞核内的转录因子磷酸化，从而调节一系列的关键基因表达，进而参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程[4]。内质网是蛋白质合成和翻译后加工的场所。当受到外部刺激后内质网会发生应激反应，上调内质网应激蛋白PERK(Protein kinase R-like ER kinase)、ATF6(Activating transcription factor 6)等蛋白上调表达，起到对细胞的保护作用。但持续的外部刺激发生时内质网应激会诱导细胞发生凋亡，造成组织损伤。本研究旨在分析ERK通路及内质网应激蛋白在Ⅱ型糖尿病大鼠白内障发生中的参与机制及PD98059的改善作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ，Streptozotocin)：Sigma，USA(临用前溶于柠檬酸缓冲液)；葡萄糖测定试剂盒：上海荣盛生物药业有限公司；mRNA提取及逆转录试剂盒购自北京天根；冷冻高速离心机(5741R)：Eppendorf，Germany；台式低速离心机(80-2)：上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂；电泳仪转印槽及PVDF膜，Bio-Rad，USA。

1.2 方法 雄性成年SD大鼠35只(220～250 g)购自浙江省实验动物中心。所有动物操作均符合江苏省实验动物管理规范。SD大鼠随机分为对照组(Cont)、糖尿病组(DM)、PD98059低剂量组(LOW)、中剂量组(MID)和高剂量组(HIGH)，每组各7只。对照组大鼠自由饮食，其余各组大鼠给予高糖高脂饲料(74.5%基础饲料+10%糖+10%猪油+5%蛋黄粉)，自由饮水。第29天对照组大鼠给予腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸钠溶液(10 ml/kg)，其余各组大鼠腹腔注射小剂量STZ(30 mg/kg，i.p.)。第64天开始各组分别进行尾静脉治疗：对照组和糖尿病组大鼠给予生理盐水，其余各组分别给予尾静脉注射等剂量的PD98059(10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L)治疗。

1.3 胰岛素抵抗HOMA-IR 血糖升高和胰岛素抵抗是Ⅱ型糖尿病的重要指标，HOMA-IR是用于评价个体的胰岛素抵抗水平的指标。胰岛素抵抗计算公式：HOMA-IR=空腹血糖水平(Fasting plasma glucose，FPG)×空腹胰岛素水平(Fasting insulin，FINS)/22.5。

1.4 Real-time PCR mRNA提取及逆转录均按照说明书进行。Real-time PCR反应条件：95℃热启动10 min；94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，72℃收集荧光，共37个循环。反应体系为20 μl：cDNA 2 μl；正向引物(10 μmol/L)0.5 μl；反向引物(10 μmol/L)0.5 μl；2.5×SYBR Green(TianGen)8 μl；无菌水 9 μ l。引物序列如下：β-actin正向引物5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'；反 向 引 物5'-CAGGAGGAGCAATGATCTT-3'；ATF-6正向引物5'-GGATTTGATGCCTTGGGAGTCAGAC-3'；反向引物5'-ATTTTTTTCTTTGGAGTCAGTCCAT-3'；PERK正向引物5'-AAGATGGTACAGTGGACGGC-3'；反向引物5'-CCGTGTTCCTGGTGAAATCT-3'。

1.5 Western blotting 晶状体组织在冰水浴中用匀浆液充分匀浆，采用考马斯亮蓝法蛋白定量后以等量蛋白进行SDS-PAGE和半干法转膜。转至PVDF膜上后5%脱脂牛奶室温条件下封闭2 h。然后与一抗4℃温孵12 h，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次后与二抗室温反应1 h。PVDF膜用PBS漂洗后用ECL混合液显色、曝光、显影、定影，用凝胶成像分析系统测定光密度，以β-actin作为参照，进行蛋白表达的定量分析。

1.6 统计学方法 数据统计应用SPSS13.0软件分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，多组间差异用方差分析法检验，事后分析依据方差齐性检验结果应用SNK或Dunnett's法检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般性状观察 小剂量注射STZ合并高糖高脂饮食后糖尿病成模大鼠饮水、尿量明显增加，体重增加明显。正常对照组大鼠的晶状体一直清亮，而糖尿病模型组大鼠晶状体周边可见到空泡，且有絮状并呈现乳白色混浊。120 d后糖尿病大鼠晶状体完全混浊，呈现乳白色。ERK受体阻滞剂PD98059干预组大鼠晶状体混浊程度较模型组轻，且高剂量组效果最好，具有剂量依从性。

2.2 血糖水平及胰岛素抵抗 Ⅱ型糖尿病组大鼠血糖水平、胰岛素水平明显增高，且与对照组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)。而药物干预后糖尿病组大鼠的FINS水平和HOMA-IR明显降低，但血糖水平变化不明显。表明PD98059虽然不具有降低血糖的作用，但能够改善Ⅱ型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗状态，见表1。

表1 糖尿病大鼠血糖及胰岛素抵抗及药物干预作用(±s)

表1 糖尿病大鼠血糖及胰岛素抵抗及药物干预作用(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.01；与糖尿病组比较，bP＜0.05，cP＜0.01。

Cont DM LOW MID HIGH 5.76±1.03 21.54±6.54a20.42±3.87 19.55±4.34 18.54±4.65b8.54±1.32 20.98±5.12a17.43±4.54b16.54±4.93c14.67±5.12c2.19±1.21 20.08±6.33a15.82±5.79b14.45±6.21c12.09±7.12c

2.3 p38蛋白的异常表达 与对照组大鼠比较，Ⅱ型糖尿病组大鼠晶状体的p38蛋白表达明显增强，且两组之间差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。ERK1/2抑制剂PD98059(20 μg/L、40 μg/L)可以明显抑制异常表达的p38蛋白，而小剂量的PD98059虽然具有一定的抑制作用，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

图1 糖尿病大鼠p38蛋白表达及PD98059的抑制作用

2.4 白内障大鼠ERK通路的激活及PD98059的改善作用 与对照组大鼠比较，糖尿病组大鼠晶状体的p-ERK1/2蛋白表达明显上调，且其抑制剂PD98059具有明显的抑制上调作用，具有剂量依从性，见图2。提示Ⅱ型糖尿病大鼠白内障并发症中ERK通路被激活。但是，本文发现各组中ERK1/2蛋白的表达变化差异无统计学意义。

2.5 Real-time PCR和Western blotting检测内质网应激蛋白ATF6和PERK的表达 糖尿病组大鼠晶状体的内质网应激分子ATF6及PERK蛋白比对照组明显上调(P＜0.01)，而中高剂量的PD98059可以明显抑制上述异常表达的蛋白，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，见图3。qPCR检测发现，ATF6和PERK的表达与Western blotting的检测结果一致，见表2。

表2 q-PCR分析PERK和ATF6在不同组中mRNA表达的差异性(△Ct)

图2 糖尿病大鼠ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达及PD98059的抑制作用

图3 糖尿病大鼠内质网应激蛋白ATF6及PERK的表达及PD98059的抑制作用

3 讨论

糖尿病及其并发症损伤机体主要通过大血管病变和微血管病变，其中糖尿病眼病是一种糖尿病微血管并发症[5]。糖尿病白内障患者随着晶状体浑浊程度的增加，会出现复视或着多视的病理状态，并进一步出现视物模糊、怕光，甚至出现看物体颜色较暗或呈黄色的状态。目前对于糖尿病白内障的病理机制并未完全阐明，临床上缺乏彻底治疗白内障的有效药物。因此，探索糖尿病白内障的发病机制，对临床治疗和新药开发具有十分重要的意义。本文在小剂量STZ联合高糖高脂饮食建立的Ⅱ型糖尿病白内障模型中中发现，激活的ERK通路及内质网应激过程参与了糖尿病白内障模型的发生及发展过程，并且ERK1/2抑制剂PD98059对白内障晶状体的浑浊具有一定的改善作用，并且对上述异常表达的蛋白都具有一定程度的恢复作用。因此，激活的ERK通路和内质网应激及其引起的细胞凋亡过程可能参与了糖尿病白内障并发症的发生过程，ERK抑制剂PD98059通过抑制p38和p-ERK1/2蛋白的上调表达及内质网应激分子PERK和ATF6的异常起到对白内障的治疗作用。

内质网是细胞内的动态的膜性细胞器，是蛋白质正确合成及修饰的场所。内质网内未折叠或错误折叠的蛋白不能转运到高尔基体内。已有的研究证实，缺氧、应激、高糖及钙超载等可引起内质网的功能紊乱，导致非折叠蛋白的聚集，引发内质网应激反应。适量应激会激活UPR，使蛋白折叠能力提高、蛋白合成抑制，以适应应激，但是长时间过强的内质网应激状态则启动细胞凋亡[6]。ERK通路是细胞外信号向细胞内转导的重要通路，其中关键的蛋白为p38和ERK1/2[7-9]。ERK通路参与了多种病理过程的发生和发展过程，其中涉及多种眼部疾病。本文发现Ⅱ型糖尿病大鼠晶状体组织中p38蛋白表达显著上调，同时p-ERK1/2蛋白也显著增高，表明Ⅱ型糖尿病白内障存在ERK通路的激活。而ERK抑制剂PD98059对上调表达的p38具有明显的抑制作用，同时对上调的p-ERK1/2也有显著的恢复作用。因此，PD98059对激活的ERK通路的抑制作用也可能是其恢复糖尿病白内障并发症的重要途径。

综上所述，激活的ERK信号通路参与了Ⅱ型糖尿病大鼠白内障发病过程，而PD95059通过抑制上调表达的p38-pERK1/2及内质网应激异常起缓解作用。

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Involvement of ERK pathway in cataract in typeⅡdiabetes and alleviations of PD98059,inhibitor of ERK.

XIAO Han,LIU Wen-bin,WAN Li.Department of Ophthalmology,Nanjing Benq Hospital,Nanjing 210019,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the involvement of ERK pathway in the pathogenesis of typeⅡdiabetic cataract and the interventions of PD98059(the inhibitor of ERK).MethodsThirty-five male SD rats were divided into five groups:control group,diabetic group,low/middle/high dose of PD98059 group(n=7 in each group).The typeⅡdiabetic cataract model was duplicated by low dose of STZ injections combined with high content of fat and sugar diet for 120 d.All the rats were administrated with normal saline or PD98059.The HOMA-IR was calculated in each group.And at the same time,the expression of ERK1/2,p-ERK1/2,p38,ATF6 and PERK were detected by Western blotting or real-time PCR.ResultsThe HOMA-IR in diabetic group was increased greatly with cloudy lens when compared to the control group.The expression of p-ERK1/2,p38,ATF6 and PERK were up-regulated dramatically in diabetic group,while the expression of total ERK has no change.PD98059 alleviated the cloudy lens in diabetic rats significantly and normalized the aforementioned abnormal proteins greatly.ConclusionActivated ERK pathway and endoplasmic reticulum stress are involved in the pathogenesis of cataract in typeⅡdiabetes.PD98059 alleviates the cataract by inhibiting the aforementioned parameters in a dose dependent manner.

TypeⅡdiabetes;Cataract;ERK pathway;PD98059

R-332

A

1003—6350（2015）07—0944—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.07.0339

2014-10-29)

刘文斌。E-mail：71655692@qq.com