大鼠糖尿病性勃起功能障碍模型的制备

潘卫兵，曹石金，谢礼仁，朱 斌，金 岩

（深圳市坪山新区人民医院泌尿外科，广东 深圳 518118）

大鼠糖尿病性勃起功能障碍模型的制备

潘卫兵，曹石金，谢礼仁，朱 斌，金 岩

（深圳市坪山新区人民医院泌尿外科，广东 深圳 518118）

目的 探讨理想糖尿病性勃起功能障碍(ED)大鼠模型的制备方法。方法90只SD大鼠，随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组各30只，每组再分为正常组(CN)和糖尿病组(DM)，每组各15只，DM组腹腔注射链脲佐菌素(STZ，65 mg/kg)诱导糖尿病大鼠模型，CN组腹腔注射等量体积的柠檬酸盐缓冲液。成模8周、12周及16周注射阿朴吗啡(APO，80µg/kg)观察大鼠阴茎勃起情况，制备糖尿病性ED大鼠模型。结果Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组中的糖尿病大鼠在8、12、16周注射阿朴吗啡后勃起次数分别为(1.0±0)次、(1.0±0)次、(1.0±0)次，勃起率分别为33.3%、21.4%、14.3%，ED发生率分别为66.7%、78.6%、85.7%。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组中的正常大鼠勃起次数分别为(2.2±0.8)次、(2.3±0.8)次、(2.0±0.7)次，勃起率均为100%，ED发生率为0。各组间勃起率比较差异均有显著统计学意义(P＜0.01)。结论采用STZ 65 mg/kg腹腔注射建立糖尿病大鼠模型方法安全有效，颈部皮下注射APO 80 μg/kg筛选糖尿病ED大鼠可行可靠。

糖尿病；勃起功能障碍；链脲佐菌素

近年来，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)发病率呈逐年增高态势，全球已确诊糖尿病患者1.5亿人，预测2025年将增至3亿[1]。糖尿病导致神经血管病变，与勃起功能障碍(Erectile dysfunction，ED)关系密切，ED在糖尿病患者中的发病率较同龄非糖尿病患者高3倍[2]。且糖尿病患者ED的发生比正常人群早，并随病程的延长而增加[3]，严重影响患者的生活质量。目前，DMED的病因和发病机制至今不完全明确有待继续深入研究，而构建DMED动物模型是研究该疾病的必要条件。本文旨在探讨构建DMED大鼠模型的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及器材 链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ，Sigma公司)，阿朴吗啡(Apomorphine，APO，Sigma公司)，柠檬酸与柠檬酸三钠(上海化工试剂公司)，ONETOUCH血糖仪及试纸(强生公司)，0.22 μm滤菌器(Corning公司)。

1.2 主要溶液的配制

1.2.1 柠檬酸钠缓冲液配制 将2.10 g柠檬酸加入双蒸水100 ml配成柠檬酸母液，称为A液；将2.94 g柠檬酸三钠加入双蒸水100 ml配成柠檬酸钠母液，称为B液；将A、B液按1:1.32比例混合，pH计测定pH值，调定溶液pH=4.0，即是所需配制STZ的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液。

1.2.2 STZ溶液的配制 将STZ溶于0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液中，新鲜配制成10 g/L浓度的STZ溶液，并用0.22 μm滤菌器过滤除菌。注意避光配制，现用现配。

1.3 实验动物和分组 8周龄雄性无特定病原体SD大鼠90只(体重250～300 g，纳入研究前与发情期雌鼠交配证实具有正常的性功能。由中山大学实验动物中心提供)。随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组各30只，每组又分为正常组(CN)和糖尿病组(DM)，每组各15只。所有大鼠均以SPF级鼠料，标准笼饲养。两组大鼠实验期间自由进食饮水。12 h/12 h昼夜照明，室内通风良好，相对湿度为50%～70%，氨浓度＜20 ppm，室温保持在18℃～20℃。

1.4 建模方法 所有大鼠适应性饲养2周，造模前禁食24 h，DM组按65 mg/kg·体重腹腔注射1% STZ溶液(pH 4.0)，CN组腹腔注射等量体积的柠檬酸盐缓冲液。

1.5 血糖与体重的测定 STZ诱导72 h后剪尾取其尾静脉血，采用血糖仪检测大鼠血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L定义为糖尿病大鼠。每周测量一次血糖和体重。血糖尚未达标者可追加半剂量STZ至成模。

1.6 DMED大鼠模型的筛选

1.6.1 APO溶液的配制 称取APO，溶解于0.9%氯化钠溶液及0.5 mg/kg的维生素C，调整体积为5 ml/kg，4℃冰箱冷藏备用。

1.6.2 阴茎勃起功能的评估 成模8周(Ⅰ)、12周(Ⅱ)、16周(Ⅲ)周时称重后将大鼠放在代谢笼中，适应环境10 min，保持室内安静，应用阿朴吗啡80 μg/kg在大鼠颈项皮肤松软处皮下注射，每只大鼠注射后观察30 min，并记录阴茎有无勃起及勃起次数。龟头充血及末端阴茎体露出为阴茎勃起1次，无阴茎勃起者为DMED大鼠。每组大鼠中有阴茎勃起者百分比为勃起率。

1.7 统计学方法 使用SPSS16.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析处理数据，以P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ糖尿病组注射STZ 3 d后测血糖各有1只尚未达DM模型标准，经追加半剂量STZ后复测血糖均达标。CN组的大鼠饮水少，尿量少，皮毛干净，有光泽，体重持续稳步增长。DM大鼠建模成功后逐渐出现典型的“三多一少”糖尿病症状。随着病程的进展，糖尿病大鼠毛色逐渐出现干枯发黄、污秽无光泽、体重下降、反应迟钝等现象，诱导糖尿病8周后陆续出现白内障。Ⅱ及Ⅲ组DM大鼠各死亡1只。

2.2 各组大鼠血糖、体重及注射APO后阴茎勃起情况 CN组血糖波动在3.1～5.0 mmol/L，DM组血糖范波动在16.7～31.0 mmol/L，两组间比较差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。DM组体重随病程进展逐渐降低，而CN组体重稳步增长。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组中的糖尿病大鼠ED发生率分别为66.7%、78.6%、85.7%，勃起次数及勃起率随病程延长而逐渐降低，与对照组比较差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 各组大鼠血糖、体重及注射APO后阴茎勃起情况(±s)

表1 各组大鼠血糖、体重及注射APO后阴茎勃起情况(±s)

注：与CN组比较，aP＜0.01，bP＜0.01。

项目 Ⅰ组 Ⅱ组 Ⅲ组血糖（mmol/L）体重(g)勃起次数（次）DM 27.1±2.7a260.56±21.23a1.0±0.0aCN 3.4±0.7 581.73±10.5 2.2±0.8 DM 28.1±2.2a231.23±19.7a1.0±0.0aCN 3.5±0.6 680.56±12.37 2.3±0.8 DM 28.9±2.3a195.42±26.8a1.0±0.0aCN 3.4±1.2 712.49±10.3 2.0±0.7

3 讨论

糖尿病性勃起功能障碍是糖尿病常见的并发症之一，为研究其发病机理和寻找有效的治疗方法，首先需建立可靠的DMED动物模型。可用于制备DMED模型的动物很多，如大鼠、狗、猫、兔、小鼠等[4-5]。而SD大鼠因抗感染力强、繁殖周期短、易于获得、价格低廉，在对盆腔、阴茎的血管及神经解剖、受体分布、性反射等方面都与人相似，备受研究者青睐[6]。因此，我们选择SD大鼠用于制备DMED动物模型。

糖尿病动物模型的构建方法有很多，包括实验性糖尿病动物模型、自发性糖尿病动物模型和转基因糖尿病动物模型等。其中，实验性糖尿病动物模型是目前最常采用的方法。STZ为一种含硝基的广谱抗生素，具有抗菌、抗肿瘤作用，且对动物胰岛B细胞具有高度特异性的毒性作用，引起胰岛素合成和分泌减少，现已成为目前广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导药物。STZ诱导的糖尿病大鼠模型因给药方式不同，其成模效率也可能不同，如果采用小剂量分次注射的给药方法，则建立与人类2型糖尿病表现相似的大鼠模型，如果采用较大剂量一次性注射的给药方法，则建立与人类1型糖尿病表现相似的大鼠模型，其机制可能与胰岛的损伤程度有关。STZ的给药途径较多，如腹腔注射、尾静脉注射以及皮下注射等，剂量为35～75 mg/kg。尾静脉注射及皮下注射操作较繁琐，且易出现误差，而腹腔注射操作简便快捷。研究表明，65 mg/kg STZ腹腔注射制备糖尿病动物模型是一种简单易行的方法[7-8]。我们以STZ 65 mg/kg单次腹腔注射，3 d后检测血糖成模率达93.3%(42/45)，在成模后12及16周期间各死亡一只大鼠，死亡率为4.44%(2/45)。本实验结果表明，我们选用SPF级雄性SD大鼠，以65 mg/kg剂量通过单次腹腔注射STZ的方法可成功构建糖尿病大鼠的动物模型。建模后大鼠血糖值始终处于高血糖水平上波动，并随着病程延长有所提高，持续观察至16周，高血糖状态未见转复，出现典型“三多一少”的糖尿病症状，这与人类2型糖尿病在临床表现及病理改变上都极为相似。我们认为采用STZ制备糖尿病大鼠模型是可靠的实验方法。

阴茎勃起实质上是在神经内分泌调控下的一系列神经血管活动，糖尿病导致神经血管病变，是与ED关系最为密切的疾病之一。APO是一种多巴胺受体激动剂，它可通过刺激下丘脑室旁核处的多巴胺受体而引起阴茎勃起，并通过骶副交感神经丛扩张阴茎海绵体血管而引起阴茎勃起。本实验通过颈部皮下注射APO 80µg/kg的方法评估大鼠的勃起功能，我们发现正常大鼠在注射APO后均有阴茎勃起，勃起率达100%，而在8、12、16周糖尿病大鼠勃起率分别为33.3%、21.4%、14.3%，勃起率显著降低，可证实糖尿病是导致ED的重要因素。糖尿病ED是糖尿病全身病变在局部表现，既往研究大多数时限在8～10周，可节省成本，但不能充分显示疾病的发展过程，本研究将病程延长至16周，可更好地反映糖尿病的病理改变。从本实验结果可以发现，随着病程延长，糖尿病大鼠的勃起功能进行性降低，设想早期进行治疗干预可能会延缓疾病进展，这将是我们下一步研究的方向。

综上所述，应用STZ 65 mg/kg单次腹腔注射建立糖尿病大鼠模型安全有效。8周后采用颈部皮下注射APO 80 ug/kg进行阴茎勃起功能实验的方法来筛选DMED大鼠模型可行可靠，为我们后续研究DMED病理生理机制和探索有效的治疗方法提供了理想的动物模型。

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Establishment of diabetic rat models with erectile dysfunction.

PAN Wei-bing,CAO Shi-jin,XIE Li-ren,ZHU Bin, JIN Yan.Department of Urology,Pingshan People's Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518118,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the ideal method for establishing diabetic rats model with erectile dysfunction(ED).MethodsNinety male SD rats were randomly divided into 3 groups(groupⅠ,Ⅱ,Ⅲ),each with 30 rats.Each group were further divided into control(CN)subgroup and diabetes mellitus(DM)subgroup equally,with 15 rats in each subgroup.SD rats were injected intraperitoneally with 65 mg/kg streptozotocin(STZ)to make experimental models of DM(DM subgroup),and equal volume of citrate buffer was injected in the CN subgroup.Injected with apomorphine,penile erection of the rat models were observed 8(groupⅠ),12(groupⅡ),and 16 weeks(groupⅢ)after establishment of models.ResultsThe times of penis erection in DM subgroups of groupⅠ,Ⅱ,Ⅲwere (1.0±0),(1.0±0),(1.0±0),respectively,and the rates of penis erection were only 33.3%,21.4%,14.3%,with the incidences of ED of 66.7%,78.6%,85.7%.The times of penis erection in CN subgroups of groupⅠ,Ⅱ,Ⅲwere(2.2±0.8), (2.3±0.8),(2.0±0.7),respectively,and the rates of penis erection were all 100%,with the incidences of ED of 0.There was statistically significant differences in the rates of penis erection between the DM subgroup and the CN subgroup (P＜0.01).ConclusionIntraperitoneal injection with STZ(65 mg/kg)is a safe method for establishment of diabetic rat model.Subcutaneous injection with apomorphine(80 μg/kg)is effective to screen diabetic rat model with erectile dysfunction.

Diabetes mellitus;Erectile dysfunction;Streptozotocin

R-332

A

1003—6350（2015）05—0629—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.05.0227

2014-08-07)

深圳市坪山新区医疗卫生发展孵化资助资金项目(编号：201206)；深圳市科技创新委员会知识创新计划基础研究(编号：201404163000117)

潘卫兵。E-mail:szys67@sina.com