中国东北人群中转化生长因子-α基因rs3771494单核苷酸多态性与非综合征唇腭裂的关系*

胥威 卢永平 韩维田 宋方田

非综合征唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）是指不伴有其他先天畸形的唇腭裂，是人类最常见的先天性畸形之一，是一种遗传、环境因素及两者相互作用所致的多基因多因素遗传疾病[1-5]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是新一代遗传标记，由于其密度高、遗传稳定性好、具有代表性、分析易自动化等特性成为第3代基因遗传标记，被认为是影响人类疾病易感性和药物反应的决定性因素[6]。在临床工作中，可以利用单核苷酸多态性这种最新的遗传标记寻找疾病的致病基因，诊断及预测疾病发生风险。其中，首次被提出的易感基因是转化生长因子-α（transforming growth factor-α，TGF-α）基因（定位于2p13），有研究证实TGF-α基因Tag I的特定C2等位基因与非综合征唇腭裂有关系，而随后有部分学者则没有得到类似的结论。目前，已经发现了TGF-α基因的356个SNP和20个插入/缺失与非综合征唇腭裂的发病相关[7]。由于地区环境和种族差异的影响，该基因在不同文献的结果也有所区别。本研究以东北地区236例非综合征唇腭裂患者及400例正常人为研究对象，用基因芯片的方法检测TGF-α基因rs3771494多态性，用以分析东北地区人群非综合征唇腭裂与TGF-α基因多态性的相关性，现具体报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2008-2012年在中国医科大学附属口腔医院就诊治疗的非综合征唇腭裂患者236例作为病例组，排除其他系统畸形及综合征唇腭裂，包括先天性心脏病伴唇腭裂、范伍德综合征、腭心面综合征及歌舞伎面综合征等。非综合征唇腭裂患者年龄1~35岁，平均（9.96±6.84）岁。其中男127例，女109例，男女比例为1.17：1。正常对照400例，年龄3~36岁，平均（10.12±7.67）岁，其中男215例，女185例，男女比例为1.16∶1。病例组及对照组样本均为东北地区人，均签署了知情同意书。

1.2 仪器与试剂 点样仪（Nano-Plotter 2.1，GeSiM，德国），GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪（Axon Instruments，USA）；TIANamp血 液 DNA 提 取 试剂 盒（TIANGEN）；TGF-α 基 因 PCR扩 增 引物： 上 游：TCACTTCCCCTTTTTCATCTG， 下 游：CGAGGAGGCTCCTGAGGTG（金斯瑞生物科技有限公司合成），产物长度为179 bp。DNA聚合酶采用NEB的vent DNA聚合酶。EXOI（Takara），碱性磷酸酶（Takara）。芯片的制备及基因型检测所用探针和特异性延伸引物及阳性对照（南京生物科技有限公司合成）见表1。

表1 TGF-α基因rs3771494位点的探针和特异性延伸引物

1.3 方法 全基因组DNA提取、PCR扩增、特异性引物延伸、杂交及基因芯片结果扫描。所有患者抽取静脉血5 mL，EDTA抗凝，-20 ℃冻存备用。所有患者均取500 μL外周血，利用TIANGEN全基因组核酸提取试剂盒提取白细胞全基因组DNA后，进行PCR扩增，反应在20 μL中进行，其中包括基因组DNA 2.5 ng， 引 物 0.4 μM，dNTP 0.125 mM，1×buffer，ventDNA聚合酶0.05 U；PCR循环条件为94 ℃变性5 min，然后 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃终止延伸。PCR产物进行特异性引物延伸，体系为15 μL：5 μL PCR产物，0.02 U ventR（exo-）DNA聚合酶，0.375 μL dATP，0.375 μL dTTP，0.375 μL dGTP，0.375 μL Cy3-dCTP，0.025 μM特异性延伸引物。延伸产物与预先准备好的芯片杂交，洗后用共聚焦激光扫描仪（GenePix 4000 B）扫描结果。GenePix 6.0读取每条探针的荧光信号强度值。基因型通过计算每个位点的等位基因分数（AF）读取，AF=等位基因B/（等位基因A+等位基因B）。AF<0.4，0.4≤AF≤0.6及AF>0.6分别为等位基因A纯合子，杂合子AB及等位基因B纯合子。通过计算结果读取基因型。

1.4 统计学处理 所得数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

病例组基因型TC、CC及TC+CC的频率均高于对照组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 TGF-α基因rs3771494位点的基因分布情况及其分析 例（%）

3 讨论

唇腭裂是最为常见的颜面部畸形，其发病率约0.018%，位居围产儿出生缺陷的第4位，属多基因遗传病，男多于女[8]。近年来，有关唇腭裂的基因定位研究是该领域的一个热点，国内外学者已做了大量的研究工作，提出了相关的染色体易感位点：3p21.2、6p23-p25、16p13.3（MMP25）、2p13 和 16q22-q24等；易感基因：TGF-α、TGF-β、MSX1、MTHFR、RARA、BCL3和IRF6等[9]。其中TGF-α基因是迄今为止发现的最有价值的与非综合征唇腭裂致病有关的基因之一[10-14]。

面部胚胎发育包括神经嵴细胞的发育和迁移，腮弓的形成，几个面突的出现、运动和相互融合等几个连续的过程，同时受生长因子（表皮生长因子和转化生长因子等）和甾类/甲状腺/视黄酸超家族的调控，其中任何一个过程和参与调控的因子的作用受到干扰，都可能导致唇腭裂的发生。TGF-α是一种多肽类生长因子，为人表皮生长因子（epidermal growth factor， EGF）家族的重要成员，具有多种生物学活性，它能激活受体上的酪氨酸激酶，激活MAPK信号系统（Raf-MEK-ERK），ERK通路激活后，信号传导因子细胞外调节蛋白激酶（ERK）进入细胞核，引起转录因子的磷酸化，导致细胞增殖。因此认为可能是TGF-α基因多态性改变了TGF-α的空间结构、组织表达及TGF-α在腭突组织中正常的表达，从而影响唇腭的正常发育。有研究表明在胚胎发育，特别是腭突的抬起和融合的关键时期，小鼠腭突组织广泛表达TGF-α[15]。因此围绕着TGF-α基因结构、功能与非综合征唇腭裂发生之间的关联性的研究成为近些年来研究的热点。TGF-α基因研究最多的是TaqI、RsaI、C3296T、Primer P、BamHI和PrimerK等位点[16]。本研究就rs3771494位点的多态性与中国东北人群非综合征唇腭裂的关系进行了分析，发现病例组基因型TC、CC及TC+CC的频率均高于对照组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）。说明在中国东北人群中TGF-α基因rs3771494位点基因型TC和CC与非综合征唇腭裂的发病密切相关。有研究采用病例对照分析方法，只发现TGF-α基因rs3771494位点与中国部分地区人群非综合征唇腭裂的发生有关。不同研究结果的差异可能与研究人群的种族及样本量有关系。

环境因素在非综合征唇腭裂的发病中也起着非常重要的作用[17]。Van Rooij等[18]证实母亲为MTHFR 677TT基因型且孕期未服用叶酸或服用叶酸的剂量较低，其后代患唇腭裂的风险较高；母亲为MTHFR 1298CC且孕期未服用叶酸或服用叶酸的剂量较低，其后代患有唇腭裂的风险较正常者高7倍。另外，国内外大量学者做了大量的临床和实验研究筛选了可能的易感性基因以及进行基因定位，到目前为止大约有20多个候选基因被发现，主要集中在TGFA、TGFB3、FR-3、MTHFR、MSX-1、BCL-3、RARA、F13A、ARNT2、EPHX1等基因和基因位点上，但不同种族、不同地区甚至不同表型非综合征唇腭裂的候选基因位点都有很大的差异性，多数结果重复性差，这些候选基因大部分仍有待于进一步研究筛选。本研究中，证实TGF-α基因rs3771494位点与中国东北人群非综合征唇腭裂的发病密切相关，将来，应该进一步同时结合多个基因和环境因素的相互作用对非综合征唇腭裂的发病进行更深入的分析，进一步阐明唇腭裂的发病机制和因素，为预防唇腭裂的发生做准备。

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