郑州地区秋冬季腹泻患儿轮状病毒基因分型及干预研究*

王艳丽 杜远举 李春力 程艳波

轮状病毒（rotavirus，RV）由澳大利亚科学家Bishop等在1973年首次发现，是引起婴幼儿感染性腹泻的主要病原体。据世界卫生组织2008年统计，RV感染造成45.3万（42.0~49.4万）幼童死亡，在发展中国家，小儿腹泻常常是婴幼儿死亡的主要原因，仅次于肺炎，排在第2位[1]。大约90%的RV感染相关死亡病例发生在亚洲和非洲的发展中国家[2]。我国每年有4万婴幼儿因RV性腹泻而死亡[3]。RV感染普遍，目前尚无治疗RV腹泻的特效药，主要采用对症治疗，纠正脱水，维持电解质平衡，因此预防极其重要[4]。

目前由于RV的型别众多且多变，其流行病学相当复杂，在不同地区不同时期的流行株各不相同，因此有必要建立广泛的RV监测网，动态监测RV流行株的变化，从而为疫苗研发提供数据支持。郑州地区为北温带大陆性季风气候，冷暖适中，四季分明，也是我国RV流行的代表性地区之一，流行高峰一般在9-12月份。本研究选择常见的6种A组RVVP7基因型（G基因型）特异引物和5种A组RVVP4基因型（P基因型）特异引物，采用RT-PCR及net-PCR技术对郑州地区婴幼儿A组RV腹泻进行P和G基因型的分子流行病学研究，并探讨使用RV干预后再次感染患儿的血清分型及临床症状严重程度的关系，为研制适合本地区的安全有效的RV疫苗提供流行病学依据.并对RV的流行病学检测提供科学数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2011年9月-2012年3月、2012年9月-2013年3月郑州市第一人民医院和郑州人民医院儿科住院部和门诊秋冬季腹泻患儿共900例。其中2011年9月-2012年3月500份，2012年9月-2013年3月400份，均符合以下临床诊断标准：（1）年龄<5岁，大便次数增多，呈水样、蛋花汤样便或稀糊状、黄绿色稀便，无黏液及脓血[5]。（2）标本逐月收集，详细记录腹泻患儿口服轮状病毒疫苗史及免疫调节剂（如干扰素、免疫球蛋白）使用史。（3）所有标本存于-70 ℃冰柜备用，详细记录每例患儿腹泻的临床表现（发热程度、每日腹泻次数、有无呕吐、有无脱水症状及脱水症状的轻重）、疗程以及有无合并呼吸道感染症状。

1.2 主要试剂 A群RV诊断试剂盒（购自卫生部兰州生物制品研究所），小量柱离心式/液体样品RNA/DNA抽提试剂盒（购自上海华舜工程有限公司），PCR扩增试剂（均购自宝生物工程大连有限公司），PCR产物鉴定利用琼脂糖凝胶电泳法。

1.3 试验方法 （1）RV的RNA提取及检测：采用酶联免疫吸附试验方法（ELISA）检测RV抗原，其操作步骤严格按照试剂盒操作：检测阳性标本用病毒/液体样品的RNA/DNA抽提试剂盒（购自上海华舜工程有限公司）抽提RNA，将装有RVRNA的1.5 mL离心管置于-70 ℃冰柜备用。（2）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增RV的VP7全长基因及巢式-聚合酶链反应（net-PCR）VP7血清型分型。分型方法见参考文献[6]。（3）巢式-聚合酶链反应（net-PCR）进行VP4血清型分型，分型方法见参考文献[7]。

1.4 统计学处理 数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RV检测结果以及RV感染的年龄和性别分布 通过ELISA方法检测结果显示，900份粪便标本中RV阳性样本为612份，阳性率为68.0%。其中男女患儿比例为2.01∶1，差异无统计学意义（P>0.05）。在7~18月年龄段患儿中RV阳性率最高（73.9%），与其他各年龄段0~6个月（7.0%）、19~36个月（16.3%）、37~60个月（2.8%）的检出率比较差异有统计学意义（P<0.01）。在轮状病毒感染病例中，小于2岁患儿所占比例较高，各年度基本一致；其中高发年龄段为6~24个月，平均发病月龄为（10.1±7.2）个月。612份阳性标本中年龄和性别分布见表1。

表1 RV阳性标本年龄与性别分布 例

2.2 不同时间RV感染的时间分布特点 RV腹泻呈全年发病，2011年9月-2012年3月及2012年9月-2013年3月RV阳性率检出最高的月份分别为2011年10月和11月，2012年9月和10月。高峰月和其他月份有差异。

2.3 不同时间RV的G血清型和P基因型型别特征 G3型在2011年9月-2012年3月为优势株，2012年9月-2013年3月G9型成为优势株，混合感染型每年均有出现。P8在每年的感染中均为优势株，并发现有混合感染型别， 2011年9月-2012年3月与2012年9月-2013年3月P基因型混合感染比率分别为14.8%和15.0%。具体G血清型和P基因型型别特征见表2、3。

表2 不同时间RV的G血清型分型 份（%）

表3 不同时间RV的P基因型分型 份（%）

2.4 不同时间RV的G血清型和P基因型组合 2011年9月-2012年3月G、P组合以G3P8为主，2012年9月-2013年3月以G9P8型为主。具体G血清型和P基因型的组合见表4。

表4 G血清型、P基因型组合 份

2.5 RV病毒分型与呼吸道感染情况 在612份阳性标本中合并有呼吸道感染的147例，其中G9P8型有67例，占45.6%，其余为混合感染型，其中G1+3P8型、G3+9P8型、G3P8+6型、G1+3P8+4型均有出现。2.6 RV病毒分型及口服轮状病毒疫苗后再次感染 900份标本中使用轮状病毒疫苗的患儿共317份，其中612份阳性标本中已使用口服RV疫苗（商品名罗特威，兰州生物制品研究所有限责任公司生产的口服RV活疫苗）再次受感染的患儿有149例，再感染的患儿149例与未使用轮状病毒疫苗患儿临床表现如：腹泻次数、发热或轻微发热及脱水症状等情况较未使用轮状病毒疫苗患儿轻。

3 讨论

2011年9月-2012年3月及2012年9月-2013年3月RV检测结果显示，郑州地区秋冬季腹泻患儿RV阳性率68.0%，其中2011年9月-2012年3月阳性率77.8%，2012年9月-2013年3月RV阳性率55.7%，高于王建阳等[8]2005年10月-2006年10月检测的RV感染阳性率51.97%及程艳波等[6]2010年郑州地区监测阳性率50%，与往年相比感染率有所增高。较国内其他城市如北京、上海、广州等地区高，证明RV仍是引起郑州地区婴幼儿腹泻的主要原因。RV检出率在男性患儿和女性患儿之间国内报道各有区别。本研究显示RV阳性率在男女患儿之间无差异。

RV的VP7蛋白是位于其外壳的主要蛋白结构，目前已有27个G血清型和35个P基因型被确定[9]。RV全球范围内最流行的组合为G1P8、G2P4、G3P8、G4P8、G9P8[10]。而我国不同地区不同时间报道的RV流行株不同，我国20世纪90年代RV感染以G1型为主，2001年以来G3型取代G1型成为成为国内主要流行株[11]。例如广州地区1994-2001年RV感染以G1型为主，2007年以G3型为主，而2008年转为以G1型为主[10]。上海地区2001-2007年G基因型以G3为优势株，G1呈下降趋势[12]。2008年-2011年G基因型出现变化，G3呈下降趋势，G9和G1呈波动上升趋势，尤其G9于2011年成为主要流行株[13]。兰州地区2001-2007年度RV主要流行株由G3型过渡到G2型，再过渡到近两年的G1型，可见年份不同流行株不同[14-15]。自1994年国内学者钱渊等[16]首次报道G9型感染病例，近年来国内G9病例陆续出现报道，任斌知等[17]研究太原市婴幼儿RV腹泻的分子流行病学特征发现2012年该市RV基因型G9成为主要优势株。上海于2011年、广西2010年均检测到G9并成为该年最主要的流行优势株[13-17]。本研究显示郑州地区2011年9月-2012年3月以G3型为主要流行株，2012年9月-2013年3月则以G9为主要流行株，证实G9作为以前稀少的流行株逐渐成为优势株，并且在郑州地区流行中占主导地位。目前RV疫苗主要是针对4个主要的流行优势株（G1~G4）来控制RV感染，而G9型RV流行越来越普遍，很有可能成为继G1~G4之后第5种最为流行的血清型，将来的RV疫苗的研制就必须引入所有常见的血清学中的中和抗原，这促使人们重新认识G9型轮状病毒感染的流行病学意义。本研究还发现G血清型混合感染病例比率2011年9月-2012年3月为13.1%，2012年9月-2013年3月混合感染病例比率15.7%，有升高趋势。混合感染比率的出现为病毒基因重组所导致流行病毒株血清型改变提供机会，而基因突变是导致病毒株多样性的主要因素。郑州地区RV混合感染病例远高于兰州地区混合感染比率，与国内其他地区相比也明显增高，这也说明RV感染比率近两年逐渐增高可能与基因突变有关。

RVVP4是组成RV的对蛋白酶敏感的非糖基化蛋白，目前引起婴幼儿腹泻的P基因型多为P8和P4型，同时也发现了一些不常见的P6型和P9型。最近研究表明P6型可引起婴幼儿有症状的腹泻，是一种与RV腹泻有关的蛋白[18]。本研究RVVP4基因分型结果显示：郑州地区2011年9月-2012年3月与2012年9月-2013年3月P基因型均以P8型为主，P4型次之，发现P6型比率为5.9%（36/612），低于广州地区2007年11月-2008年2月的P6比率22.2%[10]，兰州地区2001-2005年均未发现P6型，2006年发现P6型毒株4例[14]，张玉侠等[19]2006-2008年未发现P6型病例。李丹地等[20]研究河北省卢龙地区2008-2009年RV感染未发现P6型感染病例，发现混合感染病例较多，占28.7%。郑州地区2011年9月-2012年3月与2012年9月-2013年3月P基因型混合感染比率分别为14.8%和15.0%，较2010年王艳丽等[21]研究该地区混合感染病例增加。目前国内外均检出高比率的混合型感染病例，证明RV的多样易变，导致复杂分子流行病学出现，给RV的预防带来挑战。

G、P是两个相对独立的血清型，相同的G型毒株可有不同的P血清型。不同国家地区，同一地区不同年份流行的P基因型也可不同或出现新的G和P组合类型。随着检测方法的不断改进和流行病学检测网络的日臻完善，发现先前认为不致病或很少致病的基因型也能引起婴幼儿腹泻。本研究提示郑州地区2011年9月-2012年3月RV流行病学组合为G3P8型，2012年9月-2013年3月变为G9P8型为主，孙立美等[22]监测广州地区2012年RV分子型别以G1P8型为主，并发现不常见的G4型。高志勇等[23]监测北京地区2011年RV分子流行型别以G1+G9P8混合型为主。这显示各地区不同年份RV分子流行病学不断变化。目前国内各 地都有RV分子流行病学检测，而郑州地区既往缺乏RV分子流行病学系统的研究。

RV腹泻的严重程度和RV血清型的相关性研究一直是个热点。Bern等[24]发现感染G2型毒株患儿的症状比感染其他型别毒株患儿的症状严重，但并没有对此作出系统的统计学比较。2013年WHO在关于RV疫苗的意见书中提出RV的型别通常与疾病的严重程度无关。本课题研究发现在所有研究的RV分型中合并呼吸道感染的病例G9P8型居多，这是否与RVG9型易合并呼吸道感染有关还是与G9P8型毒力强有关，需要进一步的研究证实。

轮状病毒腹泻的临床表现为腹泻黄绿色稀水样便，发热，腹泻次数及病程较未使用患儿轻，本研究发现使用RV疫苗干预后再次感染的以混合感染病例居多，这表明疫苗有一定的保护作用，但目前疫苗保护具有局限性。曹兵等[25]研究表明我国兰州羊RV疫苗对RV腹泻的保护效果为72%，对严重RV性腹泻的保护效果为70%。目前国内对使用疫苗干预再感染的研究报道较少，需要进一步深入研究以了解干预治疗后对临床的影响。

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