武陵山区巴东县地方特色自酿葡萄酒的安全性初步评价

席晓圆，张 鹏*，向振坤，白 龙，宋发军

（中南民族大学 生命科学学院，生物技术国家民委重点实验室 武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北 武汉 430074）

葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经全部或部分发酵酿制而成的，酒精度不低于7.0%vol的酒精饮品。葡萄皮中含有的白藜芦醇对预防癌症等有着显著的疗效[1]。葡萄酒性温味甘，具有养颜护肤、抗衰抗辐射、消除疲劳、止血利尿的功效，对预防心脏病、坏血病、贫血，降低血脂等具有一定的帮助[2-3]。武陵山区野生葡萄资源丰富，当地多有秋季自酿葡萄酒的习惯，属于地方特色风味饮品之一。自酿葡萄酒具有方法简单、不使用食品添加剂、价格便宜、营养丰富等优点，因此，颇受当地民众欢迎。但由于原材料葡萄和加工工艺会对自酿葡萄酒的质量有影响（如葡萄的品种、质量与种植环境等），因而存在一定的安全风险。因此，有必要对自酿葡萄酒的理化指标、微生物指标等进行检测，对其饮用安全进行评价。

该文采用密度瓶法、气相色谱法和原子吸收分光光度法等方法对自酿葡萄酒的酒精度、干浸出物、甲醇和重金属、总酸度、总糖、菌落总数及致病菌等指标进行检测，评价自酿葡萄酒的相关指标是否符合安全饮用标准，从而为开发武陵山区地方特色风味饮品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料葡萄酒采集自湖北省恩施州巴东县的茶店子镇店子坪村。

甲醇（色谱纯）：天津光复精细化工研究所；其他试剂为国产分析纯。

真菌和细菌的分离和培养分别采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）和LA培养基，培养基成分及配制方法见文献[4]。细菌分子鉴定采用16S rDNA引物（F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

可溶性糖测定试剂盒：苏州科铭生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-3000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SP-2100A气相色谱仪：北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司；AA-6300原子吸收分光光度计：日本岛津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒的酿制

原料葡萄挑选→清水浸泡10～30 min→葡萄捏碎（葡萄皮戳破即可）→葡萄∶糖=10∶1的比例加糖（糖分两次添加：第一次在装入葡萄后24 h加入，剩余的糖在3～4 d后视发酵情况加入）→密封→18～20 ℃发酵→渣液分离→过滤→后发酵大约30 d后启封→15～20 ℃自然陈酿。

1.3.2 总酸的测定

参照文献[5]的方法进行NaOH标液的标定及样品总酸的测定。葡萄酒的总酸计算公式如下：

式中：X为样品中滴定酸的含量，g/L；C为氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；V0为空白对照消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V1为样品滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2为检测样品体积，mL；0.075为与1.00 mL氢氧化钠标准溶液相当的以克表示的酸的质量。

1.3.3 酒精度的测定

参照文献[6-7]的密度瓶法进行酒精度的测定，葡萄酒馏出液在20 ℃时的密度计算公式如下：

根据酒样蒸馏液在20 ℃时的密度，可从酒精水溶液密度与酒精度对照表（20 ℃）中查得试样中酒精含量的体积百分数，以%vol表示。

1.3.4 总糖（以葡萄糖计）的测定

使用可溶性糖测定试剂盒进行总糖的测定。计算公式如下：

式中：A为波长620 nm条件下的吸光度值；W为取样的体积，mL；X为总糖含量，g/L。

1.3.5 干浸出物的测定[8-9]

使用1.3.3中蒸出酒精后的残液，在20 ℃时用水定容至100 mL。并按密度瓶法测定酒精度，分析步骤同1.3.3操作，依据密度瓶法测定酒精度的密度。由计算公式计算出脱醇样品20 ℃时的密度ρ1，以ρ1×1.001 8的值查询密度-总浸出物含量对照表，得出总浸出物含量，g/L。根据干浸出物=总浸出物-总糖+0.05×还原糖，得出干浸出物的含量。

1.3.6 甲醇的测定

用于检测葡萄酒中甲醇含量的甲醇标准溶液的配制：用体积分数为60%的乙醇水溶液为溶剂，配制质量浓度为0.1 g/L的甲醇（色谱纯）标准溶液。

依据文献[10-11]报道的方法进行样品的制备。色谱条件：5%OV-101石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 m），载气氮气，流速300 mL/min，氢气流速30 mL/min，空气流速300 mL/min，进样量0.5 μL，柱温50 ℃，检测器温度120 ℃，气化室温度120 ℃，分别检测0.1 g/L的甲醇标准溶液和样品溶液，甲醇含量的计算公式如下：

社会形态的发展是合规律性的自然历史过程与合目的性的主体自觉选择过程的统一。我国现阶段主导性与多样性相统一的社会生态化治理基本范式，也是在主客观条件共同作用下历史地形成的。

式中：C为样品甲醇质量浓度，g/L；Cs为标准品甲醇质量浓度，g/L；A为样品甲醇峰面积；As为标准品甲醇峰面积。

1.3.7 重金属的测定

依据文献[12]的方法进行自酿葡萄酒样品的处理，并用体积分数2%的硝酸溶液配制质量浓度分别为0、0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL的镉和铅标准溶液，然后将样品和标准溶液送至中南民族大学分析测试中心采用原子吸收分光光度法进行葡萄酒中镉和铅含量的检测。

1.3.8 菌落总数的测定

依据参考文献[13]将酒样用无菌水分别稀释10、100倍后，分别涂于LA和PDA平板，LA平板于37 ℃培养48 h，PDA平板于28 ℃培养72 h，观察细菌和真菌生长的结果，并用直接计数法计数。

1.3.9 细菌的分类及鉴定

2 结果与分析

2.1 自酿葡萄酒的感官评价

自酿葡萄酒的颜色为玫瑰红色；没有悬浮物，清亮透明；具有纯净、怡人的果香；甜、酸、涩比较协调。

2.2 总酸的测定

虽然国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》对葡萄酒的总酸不作要求，但葡萄酒的总酸含量会影响其口感。该文对自酿葡萄酒样品的总酸进行检测，结果见表1。由表1可知，其平均总酸约为5.15 g/L。

表1 自酿葡萄酒样品的总酸测定结果Table 1 Determination results of total acidity of home-brewed wine

2.3 酒精度的测定

根据国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》中要求的葡萄酒的酒精度不得低于7%vol，对自酿葡萄酒样品酒精度进行检测，结果见表2。由表2可知，酒样馏出液在20 ℃时的密度为988.118 2 g/L，经查酒精水溶液密度与酒精度对照表（20 ℃）得其酒精度为8.66%vol～8.68%vol，符合国家相关标准。

表2 自酿葡萄酒样品的酒精度Table 2 Determination results of alcohol content of home-brewed wine

2.4 总糖含量

采用总糖检测试剂盒对样品进行检测，结果见表3。由表3可知，自酿葡萄酒的总糖含量为24.08 g/L，根据国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》的要求，该葡萄酒酒属于平静葡萄酒中的半甜葡萄酒（12.1～45.0 g/L）。

表3 葡萄酒样品的总糖Table 3 Determination results of total sugar of home-brewed wine

2.5 干浸出物含量

根据国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》要求，葡萄酒中干浸出物的含量≥18.0 g/L。检测自酿葡萄酒中干浸出物的含量见表4。由表4可知，葡萄酒中干浸出物平均含量为22.42 g/L，符合国标要求。

表4 葡萄酒样品的干浸出物Table 4 Determination results of dry extracts of home-brewed wine

2.6 甲醇含量

根据国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》要求，葡萄酒的甲醇含量≤400 mg/L。采用气相色谱检测自酿葡萄酒的甲醇含量，其标准品（甲醇标准溶液）和样品色谱见图1。

图1 甲醇标准品(A)与自酿葡萄酒样品(B)的气相色谱图Fig.1 Gas chromatography of methanol standard (A) and home-brewed wine sample (B)

图1（A）中0.890 min处的峰为甲醇。1.398 min处的峰为乙醇。其标准溶液的甲醇峰面积As为1 816 932.488，样品峰面积A为1 843 351.736，标准溶液的甲醇质量浓度Cs为0.1 g/L，经方法1.3.5中公式计算得自酿葡萄酒中甲醇含量为101.45 mg/L，符合国标要求。

2.7 镉和铅的含量

原国家标准GB 2758—2005《发酵酒卫生标准》规定铅≤0.2 mg/L，而在国家标准GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》、国家标准GB 15037—2006《葡萄酒》中没有规定铅的限量指标，而且GB 2758—2012和GB 15037—2006对镉含量没有要求，但国际葡萄与葡萄酒组织（organisation internationale de vigne et du vin，OIV）对葡萄酒中铅、铁、铜、镉、锌、砷、钠7种金属含量都有要求[13]。采用原子吸收分光光度法检测自酿葡萄酒中镉和铅含量的结果（表5）表明，自酿葡萄酒中镉和铅的含量甚微，分别为3.22 μg/L、40 μg/L，对人体健康不会造成危害。

表5 自酿葡萄酒样品的镉和铅含量Table 5 The Cd or Pb content of the home-brewed wine

2.8 微生物检测

国家标准GB 2758—2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》规定葡萄酒中的菌落总数≤50 CFU/mL。自酿葡萄酒中菌落总数的检测结果见表6。自酿葡萄酒中没有分离出真菌（PDA平板无真菌生长）；而1 mL自酿葡萄酒原液在37 ℃培养48 h的条件下，细菌菌落总数平均值为10 CFU/mL，符合GB 2758—2012标准的规定。对从4 mL葡萄酒中分离的40株细菌进行革兰氏染色，发现均为革兰氏阳性菌。之后，根据细菌的形态特征将其分成不同的组，并随机选择具有明显差异的10株细菌进行16S rDNA序列扩增以及分析，结果（表7）表明，各有3株细菌属于枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，各有2株属于蜡样芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌；未发现沙门氏菌及金黄色葡萄球菌等致病菌，符合国家标准（GB 2758—2012）的要求。

表6 自酿葡萄酒样品的细菌菌落总数Table 6 Total plate count of the home-brewed wine

表7 分离自酿葡萄酒样品的细菌的分类Table 7 Classification of the strains isolated from the home-brewed wine

3 结论

自酿葡萄酒营养价值丰富且酿制方法简单，不添加任何食品添加剂，靠葡萄自身携带的酵母菌自然发酵而成[15]。原材料葡萄的生长环境及自酿工艺等，会影响自酿葡萄酒质量与安全，比如土壤环境会影响葡萄中重金属和微生物的含量，自酿工艺会影响葡萄酒中的甲醇含量[16]，这些会导致自酿葡萄酒饮用的不安全性。

鉴于对武陵山区地方特色饮品的开发，本研究采集了当地的自酿葡萄酒，运用密度瓶法、气相色谱法、原子吸收分光光度法、酸碱滴定法及微生物培养法对自酿葡萄酒的酒精度、干浸出物、甲醇、重金属、总酸度、菌落总数及致病菌等指标进行了检测，根据国际葡萄和葡萄酒组织（OIV）规定以及国家标准（GB 15037—2006、GB 2758—2012）对其安全性进行了初步的评价：酒精度、干浸出物、甲醇、总酸、菌落总数和致病菌等指标均符合相关标准。并根据该葡萄酒中总糖的含量，将该葡萄酒划分为平静葡萄酒中的半甜葡萄酒。结果表明，武陵山区茶店子镇的自酿葡萄酒色泽红艳清亮、香甜怡人、酸涩比较协调，检测指标均符合相关标准，可作为一项饮用安全的具有开发潜力的地方特色饮品。

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