一株乳酸乳球菌的降胆固醇特性及其作用机制

国立东，王丽群，蒋 琛，刘晓艳，于纯淼，孟 丹

（1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省农业科学院食品加工研究所，黑龙江 哈尔滨 150086）

胆固醇是人体内重要的生理活性物质，但血清胆固醇水平过高可能会导致动脉粥样硬化，进而可能提高心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）发生的危险性。世界卫生组织（world health organization，WHO）报道了全球30%人群的死亡源于CVDs，并预测未来20年CVDs将成为人类主要的死因[1]。自20世纪70年代MANN G V等[2]发现野生乳杆菌发酵乳具有降低人体胆固醇的作用以来，乳酸菌作为美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）评价食品添加剂的安全性指标（generally recognizedas safe，GRAS）级食品微生物，其降胆固醇作用已通过大量体内外试验得以证实，主要集中在属于肠道正常菌群的乳杆菌属和双歧杆菌属两个菌属[3-5]。我国乳酸菌菌种资源丰富，已有众多学者先后从我国传统发酵食品中分离并筛选到性状优良的菌株，包括降胆固醇作用的功能乳酸菌菌种[6-8]。随着研究的深入，乳酸菌降胆固醇作用的机理假说不断被揭示，主要基于生长培养基、细胞模型、动物模型而提出，同样集中在乳杆菌属和双歧杆菌属[9]，关于乳球菌属菌株降胆固醇机制的探讨并不多见。鉴于此，本试验对先前获得的一株益生特性良好[10]，且能改善高胆固醇血症小鼠血脂轮廓[11]的乳酸乳球菌乳亚种（Lactococcuslactissubsp.lactis）HUCM 201菌株体外降胆固醇特性及其作用机制做进一步研究，旨在为其作为降胆固醇益生菌的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸乳球菌乳亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis）HUCM 201菌株：实验室自行分离鉴定并保存。牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、甘氨脱氧胆酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸钠：美国Sigma公司；溶菌酶：美国Amresco公司；其他试剂均为分析纯。

改良MRS（mMRS）培养基参照文献[12]介绍的方法配制：蛋白胨5 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉膏5 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 g，乙酸钠5 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，柠檬酸氢二铵2 g，K2HPO42 g，蒸馏水加至1 L，并用HCl调至pH 6.2，121 ℃湿热灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

DM2500显微镜：上海徕卡显微镜有限公司；PB-10pH计：赛多利斯科学仪器北京有限公司；AE200分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；TGL-20bR离心机：上海安亭科学仪器厂；SP-752紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；SPX-200-II生化培养箱：上海跃进医疗器械厂；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；BXM-30R全自动高压灭菌锅：上海博讯实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养与活化

乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201菌株采用mMRS培养基37 ℃培养24 h。试验前至少用mMRS培养基活化3次。

1.3.2 体外去除胆固醇能力的检测

将活化后的乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201菌株按1%接种量接种于mMRS-THIO-OX-CHOL液体培养基（mMRS培养基分别补加0.2%巯基乙酸钠、0.3%牛胆汁和100μg/mL胆固醇）中，37 ℃厌氧培养24 h，培养液经12000×g（4 ℃）离心10 min得上清液。采用邻苯二甲醛法[13]分别检测上清液及接种前培养基中的胆固醇含量。菌株对胆固醇去除率按下列公式计算：

1.3.3 体外去除胆固醇的机制研究

活化的菌株按1%接种量接种至mMRS-THIO-OXCHOL液体培养基中，37 ℃厌氧培养24 h，12 000×g（4 ℃）离心10 min得“上清液”。随后，将离心得到的菌泥用MRSTHIO-OX液体培养基连续洗涤3次并收集上清液，合并3次所得上清液，并补加MRS-THIO-OX液体培养基至初始培养液相同体积，即为“洗涤液”。同时，将菌体细胞用mMRS-THIO-OX液体培养基悬浮，加溶菌酶至终质量浓度为2 mg/mL，37 ℃水浴30 min，立即冰浴下超声波破碎细胞，同样补加MRS-THIO-OX液体培养基至初始体积，12 000×g（4 ℃）离心10 min取上清得“细胞裂解液”。同样采用邻苯二甲醛法分别对初始胆固醇对照、菌株培养液的离心上清液、洗涤液以及细胞裂解液中胆固醇含量进行测定，检测胆固醇在各个部分的分布情况。菌株对胆固醇的降解率按下列公式计算：

1.3.4 胆盐水解酶活力测定

乳酸菌的胆盐水解酶（bile salt hydrolase，BSH）活性是通过检测其从结合型胆酸盐释放出游离氨基酸（牛磺酸或甘氨酸）的量进行评价。活化的菌株HUCM 201按1%接种量接种于mMRS肉汤中，37 ℃培养20 h后，发酵液经12 000×g（4 ℃）离心10 min得菌泥，并经冰浴条件下超声波破碎细胞，以提取粗酶液，分别与5种不同结合型胆酸盐共培养后，采用茚三酮试剂对释放出的牛磺酸或甘氨酸进行检测，具体步骤参见文献[14]。分别以牛磺酸和甘氨酸为标准品绘制标准曲线，确定菌株的BSH活性。BSH活力单位定义为每分钟粗酶液从底物释放牛磺酸或甘氨酸的酶量为一个酶活单位，U/mL。比酶活定义为每1 mg蛋白质所含BSH的活力单位数，U/mg。

1.3.5 蛋白质质量浓度测定

采用Bradford法[15]测定蛋白质质量浓度，牛血清白蛋白为标准品，绘制标准曲线。

1.3.6 数据统计分析

统计软件SPSS17.0用于试验数据的处理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株HUCM 201的降胆固醇作用

乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201菌株培养于含胆固醇的培养基后，对培养基中胆固醇的去除能力见表1。

表1 乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201菌株的体外胆固醇去除能力Table 1 In vitro cholesterol removal ability of L.lactis subsp. lactis HUCM 201

从表1结果可知，菌株HUCM 201接种于mMRS-THIOOX-CHOL液体培养基，经37 ℃培养24 h后，能将培养基中胆固醇质量浓度从101.2 μg/mL降至67.7 μg/mL，去除了培养基中33.1%的胆固醇，其胆固醇去除率略高于L.lactissubsp.lactisbiovardiacetylactisATCC 13675（31.0%）[16]。

2.2 菌株HUCM 201体外去除胆固醇的机制

图1 不同部分的胆固醇质量浓度Fig.1 The cholesterol concentrations in different fractions

含有胆固醇的培养基经菌株HUCM 201发酵后，培养基中胆固醇的去向可能有4个方面：（1）发酵液离心上清液中残留的胆固醇；（2）菌泥洗涤液中的胆固醇；（3）细胞内的胆固醇；（4）菌株降解的胆固醇。菌泥洗涤液中含有的胆固醇是由于乳酸菌具有BSH活性，其能将胆汁中的结合型胆酸盐降解成游离的胆酸盐，新生成的游离胆酸盐能与胆固醇在低pH值条件下形成沉淀即共沉淀作用机理，经pH 6.0的mMRS-THIO-OX液体培养基洗涤后能重新得以溶解[17]。细胞裂解液中含有的胆固醇是由于乳酸菌细胞能够吸收周围环境中的胆固醇[18]。将最终没有复得的胆固醇归于乳酸菌对胆固醇的降解作用，通过对菌株发酵液处理得到的上清液、洗涤液、细胞裂解液以及初始胆固醇含量的检测，便可知菌株HUCM 201是通过何种机制将培养基中胆固醇去除的，结果见图1。

从图1可知，菌株HUCM 201发酵mMRS-THIO-OXCHOL液体培养基后，上清液中胆固醇占（66.9±1.3）%，洗涤液中胆固醇占（14.3±1.0）%，细胞裂解液中胆固醇占（18.1±1.3）%。菌株对胆固醇的降解率为0.7%，由此可认为菌株并不能降解胆固醇。由此判定，菌株HUCM 201对培养基中胆固醇的去除，主要归因于其菌体细胞对胆固醇的吸收作用和BSH活性引起的共沉淀作用两个方面，这与GRILL J P等[18]的研究结果一致，但乳酸菌吸收胆固醇到细胞内，并未将其降解，其生物学意义仍有待进一步证实。

2.3 菌株HUCM 201的BSH活性

乳酸菌的BSH活性具有底物特异性，为了进一步验证HUCM 201菌株BSH活性的主要作用底物，分别以5种常见结合型胆酸盐为检测底物，对菌株HUCM 201的BSH活性进一步加以确定，从而深入揭示其降胆固醇的机制。乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201菌株的BSH活性检测结果见表2，分别用总酶活（U/mL）和比酶活（U/mg）表示酶活性。

表2 乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201菌株的BSH活性Table 2 The BSH activity of L.lactis subsp. lactis HUCM 201 strain

从表2结果可知，菌株HUCM 201对5种结合型胆酸盐表现出了不同的BSH活性，具有底物特异性。其中，对甘氨胆酸钠展现出了最高的BSH活性，总酶活为0.279 U/mL，比酶活为0.076 U/mg；对甘氨鹅脱氧胆酸钠的BSH活性最低，总酶活为0.049 U/mL，比酶活为0.013 U/mg；对牛磺胆酸钠和牛磺脱氧胆酸钠的BSH活性居中。乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201对甘氨胆酸钠的水解强度是甘氨脱氧胆酸钠的4.9倍，是甘氨鹅脱氧胆酸钠的5.7倍，是牛磺胆酸钠的3.2倍，是牛磺脱氧胆酸钠的3.4倍。由此推测，菌株HUCM 201共沉淀部分的胆固醇主要归因于其对甘氨胆酸钠的水解作用。

3 结论

乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201菌株可从培养基中去除33.1%的胆固醇，体外去除胆固醇的机制主要归于其对胆固醇的吸收作用和其BSH活性而引起的共沉淀理论两个方面，并未发现其对胆固醇的降解作用，此外发现其对甘氨胆酸钠的水解活性最高，在共沉淀的发生中起主要作用。

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