2型糖尿病肾病气阴两虚型动物模型的建立及评价*

胡爱民，晏 玲，张利芳，赵 静，张显林，万巧巧

(1．武汉市中医医院内分泌科，武汉 430014;2．湖北中医药大学研究生，武汉 430014)

2型糖尿病肾病气阴两虚型动物模型的建立及评价*

胡爱民1，晏 玲1，张利芳1，赵 静1，张显林1，万巧巧2

(1．武汉市中医医院内分泌科，武汉 430014;2．湖北中医药大学研究生，武汉 430014)

目的:建立2型糖尿病肾病气阴两虚型病证结合动物模型。方法:雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为空白对照组(C 组)和模型组(M组)，空白对照组(C组)通过单肾切除、高脂饲料、小剂量STZ腹腔注射、行为干预(饥饱失常、过度疲劳、惊吓)建立模型组(M组)，模型动物给予益气养阴中药干预(Z组)。16周后检测各组大鼠糖脂代谢、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、24 h尿白蛋白定量、尿β2微球蛋白、肾功能、右肾重/体质量等指标;光镜下观测肾组织病理。结果:与C组比较，M组大鼠肾功能无明显变化，余指标均有显著变化。与M组比较，Z组大鼠肾功能无变化，其余指标均有显著改善。光镜结果显示，M组肾组织出现了较明显的病理改变，而Z组病变程度有所减轻。M组大鼠出现气阴两虚证型表现，Z组大鼠上述表现有明显改善。结论:通过单肾切除、高脂饲料、小剂量STZ腹腔注射、一定的行为干预方式，可制备2型糖尿病肾病气阴两虚型病证结合动物模型。

2型糖尿病肾病;气阴两虚型;动物模型

为研究方便，笔者采用单肾切除、高脂饲料、小剂量STZ腹腔注射、行为干预方法，试图建立与临床相吻合的2型糖尿病肾病气阴两虚型病证结合大鼠模型并对其进行评价。

1 材料与方法

1．1 动物及饲料

SPF级Wistar雄性大鼠，体质量100～120 g，购自湖北省疾病控制中心实验动物中心。高脂饲料由基础饲料、猪油、胆固醇粉、胆酸钠粉按87．5%、10%、2%、0．5%比例混合而成。

1．2 药物及试剂、仪器

益气养阴中药复方由生黄芪、太子参、生地黄、山药、山茱萸、茯苓、丹皮、五味子、赤芍、三七等中药组成，用“水煮醇提法”制备成浸膏，用生理盐水稀释成每毫升含生药2．5 g的溶液。链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，以0．1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH=4．4)配成2．0%STZ溶液。强生稳豪倍优血糖仪由强生(中国)医疗器械有限公司提供;血糖试剂盒购自购自南京建成生物工程研究所;血清胰岛素、尿β2微球蛋白试剂盒购自深圳新产业生物医学工程股份有限公司;血脂、肾功能试剂盒购自北京恩济和生物有限公司;尿微量白蛋白试剂盒购自山东博科生物产业有限公司。

1．3 动物分组及处理

Wistar大鼠36只适应性喂养10 d，按随机数字表法分为模型制备组26只和空白对照组(C组)10只，模型制备组以1% 戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，常规消毒，背部切口1～1．5 cm暴露左肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎左肾门血管，切除左肾并缝合切口，5万U青霉素腹腔注射。术后肌注2 万U青霉素共1周。C组大鼠仅完全暴露左肾并不作任何处理。1周后模型制备组给予高脂饲料，C组给予基础饲料，自由饮水，喂养2周。模型制备组腹腔注射STZ 30 mg/kg，C组注射等量0．1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。72 h后行糖耐量试验(OGTT，按2．2 g/kg喂以葡萄糖水、剪尾取血，葡萄糖氧化酶电化学法测血糖)，空腹血糖≥5．6 mmol/ L，负荷后2 h血糖≥7．8 mmol/L为造模初步成功，按随机数字表法分为模型组(M组)和中药组(Z 组)。Z组以10 g/kg·d灌胃，M组和C组灌予等体积的饮用水，头4周M组和Z组给予饥饱失常(单日禁食，自由饮水;双日不限量给予高糖高脂饲料，自由饮水)、过度疲劳(反复于(43±0．5)℃、水深35 cm的恒温水槽中游泳，自然下沉时从水槽取出，每日1次)、惊吓(猫叫声吓鼠、棍棒敲鼠笼，每日1次)。实验结束前1周采用金属代谢笼收集24 h尿标本。实验结束前1 d行OGTT实验(葡萄糖氧化酶法)。实验结束，禁食12～14 h称重，戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉取血分离血清，剥离右侧肾脏，生理盐水清洗并吸干水分称重，留取部分肾组织固定备用。

1．4 检测方法

所有指标均严格按试剂盒说明书进行检测。

1．5 统计学方法

采用SPSS 11．5软件进行统计分析，计量资料方差齐用t检验，方差不齐采用t’检验。

2 结果

单肾切除后所有大鼠均存活，STZ腹腔注射3 d后，共有3只大鼠死亡，第2、6、7周Z组分别死亡1只，第9、12周M组分别死亡1只，造模成功率69．23%。

2．1 各组大鼠 FBG、P2hBG、FINS、P2hINS、HOMA-IR、体质量结果比较(表1)

2．2 各组大鼠TC、TG、HDL-c、LDL-c结果比较(表2)

2．3 各组大鼠BUN、Creat、24 h尿白蛋白定量、右肾重/体质量结果比较(表3)

表1 各组大鼠体质量、FBG、P2hBG、FINS、P2hINS、HOMA-IR结果比较

表2 各组大鼠TC、TG、HDL-c、LDL-c结果比较

表3 各组大鼠血BUN、Creat、24 h尿白蛋白定量、右肾重/体质量结果比较

2．4 肾组织病理结果

C组大鼠肾小管、小管间质区结构清楚，肾小管上皮细胞呈方形、大小一致、排列整齐;基底膜完整，间质中未见炎症细胞浸润、纤维组织增生及肾小球硬化。M组局部肾小管间质纤维化伴大量炎性细胞浸润，如黑色箭头所示;部分肾小球系膜细胞增生，如红色箭头所示;中等数量的肾小球壁层上皮细胞增生，如黄色箭头所示;部分肾小管上皮细胞脱落，颗粒变性，如蓝色箭头所示。Z组肾小球系膜细胞轻度增生，如黑色箭头所示;部分肾小管颗粒变性，如红色箭头所示。3个组的病变程度由轻到重依次为C组、Z组、M组(图1)。

图1 各组大鼠肾组织病理变化(HE染色 ×400)

2．5 各组大鼠一般情况

C组大鼠饮食、饮水正常，尿量正常，大便黑褐色颗粒状，肌肉丰满，毛发洁白顺滑，精神饱满，双目有神，反应灵敏，舌淡红润泽;M组大鼠出现饮食、饮水、尿量增多、身体消瘦、拉尾排便、排尿等糖尿病大鼠的共同特征，同时还伴有倦怠懒动、喜蜷卧或成堆趴卧，少数急躁易怒、易惊恐斗殴、毛色暗黄无光泽、舌胖大少津等气阴两虚表现，而Z组大鼠上述症状和体征均有一定程度的改善。

3 讨论

糖尿病肾病(DN)是终末期肾病(ESRD)最主要的原因之一［1-2］，约占全部ESRD病例的44%［3］，研究糖尿病肾病中医现代机制受到人们的重视，故建立一个与临床表现相吻合的病证结合动物模型尤为重要。

目前国内外主要采用诱导形成、自发形成和基因工程制备DN模型［4］。本实验参考相关文献［5-8］，一方面，用单侧肾切除、高脂饲料喂养、小剂量STZ腹腔注射，建立2型糖尿病肾病动物模型。研究表明［9］，高脂饲料喂养、小剂量STZ腹腔注射符合2型糖尿病病理生理特征，单侧肾摘除加速DN的形成。本实验中模型组大鼠出现体胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱、白蛋白尿及尿β2-微球蛋白和肾组织病理变化，而肾功能指标尚未明显升高，其发病过程及特征与糖肾患者的临床表现基本类似，具备早中期2型糖尿病肾病的典型特点。另一方面，DN属于中医学“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“消肾”、“虚劳”、“关格”等范畴。气阴两虚是本病基本病机，病位主要在脾肾。本研究根据中医学“饮食自倍，肠胃乃伤”(《素问·痹论论》)、“劳则气耗”(《素问·举痛论》)、“恐伤肾”(《素问·阴阳应象大论》)、“恐则气下”(《素问·举痛论》)的理论指导，采用饥饱失常、过度疲劳、惊吓的“行为干预”方式喂养模型动物。与对照组比较，模型组大鼠出现明显气阴两虚症状，而益气养阴中药组大鼠症状改善，无论是从临床表现还是以方药反证，2型糖尿病肾病大鼠气阴两虚证型成立。现代医学证实，大鼠因惊吓致应激而产生IL-6、TNF-α等升高，IL-10减少［10］，从而促进DN的发生发展［11］。同时激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，导致肾脏血流动力学改变和肾脏损害［12］;过度运动时血液的重新分配、缺血再灌注损伤是蛋白尿形成的基础［13］。陈璐璐等采用半量普通饮食喂养4周后，自由开放饮食喂养8周，82.25%的实验动物在限食后开放饮食过程中出现“追赶生长”，导致动物胰岛素抵抗［14］，“饥饱失常”行为与其相似。

目前有报道在小剂量STZ注射加高脂高糖喂养建立糖尿病基础上，有人给予苦寒中药等建立阳虚糖肾模型和气阴两虚糖尿病模型［15］。我们认为，药物干预建立病证结合模型不利于下一步开展的中药研究，故我们在2型糖尿病肾病模型基础上采用“行为干预”方法建立气阴两虚病证结合模型，为下一步的工作打下基础。

综上所述，本研究首次在传统方法单肾切除、高脂饮食、小剂量STZ腹腔注射制作糖尿病肾病模型基础上，在中医学和现代医学理论指导下，首次运用“行为干预”方式，初步建立了既有现代医学2型糖尿病肾病特征、又符合中医学气阴两虚证型特点的病证结合大鼠模型。我们认为，此模型与人类2型糖尿病肾病气阴两虚型的临床表现、实验室检查结果相似，且耗时较短、成本低、成功率高、易推广;特别是改变了现有报道中用苦寒、温阳、破气等中药制作相应中医证候模型的现状，为方便后续中医药干预研究打下基础，是一种研究2型糖尿病肾病气阴两虚型病证结合良好的动物模型。

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Establishment and Evaluation about Rat Models of Qi and Yin Deficiency in Type 2 Diabetic Nephropathy

HU Ai-min1，YAN Ling1，ZHANG Li-fang1，ZHAO Jing1，ZHANG Xian-lin1，WAN Qiao-qiao2
(1．Wuhan hospital of Traditional Chinese Medicine，Hubei Wuhan 430014，China; 2．Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Hubei Wuhan 430014，China)

Objective:To establish models of Qi and Yin deficiency disease andsyndrome in type 2 Diabetic Nephropathy．Methods:Male Wistar rats were ran-domly divided into model preparation group and control group (group C)，prepared using unilateral nephrectomy+high-fat diet+ low dose of streptozotocin by intraperitoneal injection，combined behavioral manner intervention，animalmodel group(M group)and Yiqiyangyin medicine group (Z group)．Z rats orally administered Yiqiyangyin medicine 16weeks，the rest of the groupto an equal volume of water．After16 weeks，detecte body weight，fasting bloodglucose、fasting serum insulin(FINS)，insulin(P2hINS) afterload，insulin resistance index(HOMA-IR)，24-hour urinary albumin quantification，urineβ2 microglo-bulin、blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(Cr)，kidney weight/body weight and other indicators of the rats;Light microscope observe pathology of the renal;Results:Compared with group C，M group weight，Creatno significant change，the other indexes were significantly improve．Compared with M group，Z rats BUN，Creatno significant change，the other indexes were significantly improve．Lightmicroscopy:M renal tissue appeared obvious pathological changes，and Z group lesions abated．M rats appear Qi andYin Deficiency performances，and Z rats had significant improvement to the performance．Conclusion:by unilateral nephrectomy + high-fat diet+ alow doseof STZ，combined with irregular diet，fatigue，behavioral manner intervention，models of Qi and Yin deficiency disease and syndrome in type 2 Diabetic Nephropathy ratswere successfully established．

Type 2 diabetic nephropathy;Qi and Yin deficiency;Animal model

R587．1

B

1006-3250(2015)10-1251-03

2015-04-06

湖北省卫生计生委(2013Z-Y36);武汉市2014年“黄鹤英才(医疗卫生)”计划;武汉市卫生局(武卫(2009)76号)

胡爱民(1963-)，男，主任医师，教授，硕士研究生导师，从事中医内分泌代谢病的临床与研究。