益气解毒活络中药复方对糖尿病大鼠肾脏病理组织结构的影响*

付 晓，李敬林

(1.辽宁医学院附属第一医院中医针灸科，辽宁锦州 121001; 2.辽宁中医药大学附属医院老年病科，沈阳 110032)

益气解毒活络中药复方对糖尿病大鼠肾脏病理组织结构的影响*

付 晓1，李敬林2

(1.辽宁医学院附属第一医院中医针灸科，辽宁锦州 121001; 2.辽宁中医药大学附属医院老年病科，沈阳 110032)

目的:探讨益气解毒通络中药复方(YQJDHL)对糖尿病(DM)大鼠肾脏结构的影响。方法:SPF级健康雄性SD大鼠72只，注射链脲佐菌素造成糖尿病及痰浊瘀毒中医证候模型。应用YQJDHL分别在造模成功及成模后2周灌胃给药，观察大鼠肾脏病理组织学变化。结果:YQJDHL能够减轻糖尿病肾病(DN)大鼠肾小球肥大、系膜细胞增生等病理改变，中药预防组疗效优于中药治疗组。结论:YQJDHL能够预防和治疗大鼠早期DN，其机制可能与延缓肾脏病理组织损害有关。

益气解毒活络中药复方;糖尿病肾病;大鼠

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)最重要和最常见的并发症之一，是慢性肾衰最常见的病因及DN患者死亡的主要原因。中医药防治早期DN有一定的临床疗效，但其病理机制和疗效机理尚未完全阐明［1］。辽宁省名医李敬林教授长期应用益气解毒活络法及其方药治疗早期DN取得良好的临床疗效。本研究旨在观察益气解毒活络(YQJDHL)中药复方对实验性糖尿病大鼠早期肾脏结构的影响，探讨可能的机制，为临床防治DN提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

选择健康雄性SPF级SD大鼠72只，体质量(200±20)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号0194036)，大鼠一般状态良好，皮毛光泽，进食与活动正常。

1.2 环境及饲料

1.2.1 饲养环境 辽宁中医药大学实验动物中心SPF级实验室笼养，室内通风及光线良好，温度、湿度适宜。

1.2.2 动物饲料 普通饲料配方:40%玉米面，26%白面，10%麸子，10%鱼粉，10%豆饼，2%矿物质，1%粗盐，1%复合维生素，购于沈阳市于洪区前民饲料厂。高糖高脂饲料配方:61.5%普通饲料，20%蔗糖，10%猪油，5%蛋黄粉，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，由沈阳市于洪区前民饲料厂配制。

1.3 药物

1.3.1 受试药物 YQJDHL中药复方，由黄芪30 g、黄精50 g、黄连9g、虎杖15 g、泽兰30 g、水蛭粉6 g组成。免煎中药配方颗粒组成由辽宁中医药大学附属医院药局提供，江阴天江药业有限公司生产。临用时蒸馏水配制成含生药3 g/ml浓度汤剂。

1.3.2 西药对照药物 盐酸贝那普利片(洛汀新)由北京诺华制药有限公司生产(批号X1496，规格10 mg/片)。将药物捣碎后用生理盐水溶解，配成0.09 g/L浓度，按1 ml/100 g(体质量)剂量，每日灌胃1次。

1.3.3 造模药物 STZ为美国Sigma公司生产，购于沈阳博瑞斯特商贸有限公司，临用前用0.1 mol/L无菌枸橼酸—枸橼酸钠缓冲液(PH 4.2)配制成浓度为10 mg/ml的STZ液。

1.4 主要仪器

LEICA-RM2235型超薄切片机:瑞典;显微摄影机:Nikon UFX-II型，日本;照相机:Nikon FX-35型，日本。

2 方法

2.1 动物模型的建立

造模组给予高脂高糖饲料喂养4周，使体质量达到300 g以上;禁食12 h，按照35 mg/kg(体质量) STZ单次尾静脉注射(注射前用0.1 mol/L无菌枸橼酸缓冲液(pH4.2)配制);正常组注入等量的无菌枸橼酸钠缓冲液。72 h后断尾取血，测大鼠全血空腹血糖≥16.7 mmol/L者确定为DM模型，血糖稳定1周后列入观察对象。造模期间有5只大鼠血糖值偏低未列入观察对象，成模率为91.94%(57/ 62)。

2.2 动物分组及给药方法

将成模的57只大鼠按照血糖值再次进行随机分组，分为模型组13只，中药预防组11只，中药低剂量治疗组11只，中药高剂量治疗组11只，阳性西药对照组11只。模型组及各治疗组观察2周后测大鼠空腹血糖值，代谢笼收集大鼠24 h尿液待测尿微量白蛋白值(辽宁中医药大学附属医院检验科检测)。注射STZ 2周后，除中药预防组外，模型组2只大鼠、中药低剂量治疗组与阳性西药对照组各有1只大鼠血糖值恢复至正常值以下，均舍弃不用。

正常组和模型组给予等量生理盐水2 ml灌服;将中药颗粒剂溶于蒸馏水中，中药预防组、中药低剂量治疗组及阳性西药对照组大鼠每日用药量按人体(g/kg)－大鼠体表面积比值的等效剂量，即6.3倍计算;中药高剂量治疗组的用药量为中药低剂量治疗组的3倍。中药预防组在注射STZ成模后立即开始灌服中药复方，共计给药6周;中药低剂量治疗组、中药高剂量治疗组及阳性西药对照组均在成DM模2周后灌胃给药，共计给药4周。实验期间自由饮水，不使用胰岛素和其他降糖药。

2.3 取材

实验结束代谢笼收集尿液后，大鼠禁食不禁水12 h，上午9时称重，10%水合氯醛3 ml/kg体质量腹腔注射麻醉大鼠，置于解剖台上，取仰卧位于腹部切开皮肤，剥离腹腔脏器露出腹主动脉，行腹部主动脉穿刺取血。大鼠处死后剥离并迅速取出双侧肾脏，生理盐水清洗，滤纸吸去脏器表面血液，去除包膜;将左肾纵向对半剖开，一半置于多聚甲醛中固定，待用于组织形态学和免疫组织化学光镜检查。

2.4 指标检测和方法

用生理盐水清洗取出肾组织，滤纸吸去脏器表面液体，除去包膜在4%多聚甲醛中固定24 h，75%、85%、95%、100%乙醇梯度脱水12 h，50～60℃的蜡浸1～2 h，标本包埋，制作成蜡块，冷台冷冻2 h后，LEICA-RM2235型超薄切片机切成5 μm厚度的薄片，按实验分组进行编号，置于70℃烤片机中烤片2 h;切片脱腊至水:二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、85%、70%乙醇各5 min;蒸馏水洗2 min，苏木素(HE)染色10 min，自来水冲洗;1%盐酸酒精分化1 min，自来水冲洗，0.5%氨水返蓝30 min;自来水冲洗，伊红染液5 min;70%、80%、90%、95%乙醇各3 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，中性树胶封固;光学显微镜下观察肾脏的基本病理变化并拍照。

3 结果

肾组织光镜病理形态学观察，HE染色、肾组织细胞核在光镜下呈现紫蓝色，细胞浆、肾小球基底膜(GBM)和胶原纤维呈粉红色。正常组可见正常肾小球，细胞未见明显增大或萎缩，肾小球系膜区较窄，ECM与系膜细胞分布正常，毛细血管腔呈现开放状态，红细胞满视野。模型组大鼠肾脏体积多数增大，光镜下可见肾小球细胞增大明显，GBM增厚，部分肾小球系膜细胞呈中度增生、系膜区增宽，部分肾小管出现上皮空泡变性，管腔内可见蛋白样物。经干预治疗后，各治疗组大鼠上述病变均有不同程度改善;肾脏体积与模型组比较大多减小，但仍较正常组肾脏有所增大;光镜下可见，肾小球细胞轻度增大，GBM轻度增厚、系膜区轻度增宽及肾小管空泡变等病变范围，与模型组比较小且轻，未见肾小球硬化及肾间质纤维化。治疗组间未见明显差异(见图1)。每个样本分别在肾脏皮质与近髓质区随机取5个肾小球，观察肾脏系膜细胞的增生情况。分级标准参照郑旭［2］等分级方法，将肾小球系膜增生分为0～Ⅲ级。0级:正常肾小球系膜细胞;Ⅰ级:系膜增生宽度小于毛细血管直径，呈节段性分布;Ⅱ级:系膜增生宽度大于毛细血管直径，呈弥漫性分布;Ⅲ级:系膜增生宽度呈团块状聚集，弥漫指状分布，挤压血管腔。肾组织半定量分析结果显示，经YQJDHL中药复方治疗后的中药实验组和阳性对照组分别与模型组比较，肾脏病理损伤均明显减轻(P＜0.05);中药实验组与阳性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，说明实验大鼠注射STZ后，大鼠肾脏出现较明显的病理损害，而给予YQJDHL中药复方治疗后，病理损害明显减轻。

图1 成模后4周末各组大鼠肾脏病理的变化(HE染色，光镜×200)

4 讨论

根据DN的病因病机及临床表现，可将其归属于中医“肾消”、“尿浊”、“肾劳”、“水肿”、“消渴”等范畴［3］。中医理论认为，DN的成因多是由于先天不足、后天失养。先天不足主要为肾精亏虚所致，后天失养多为饮食不节、情志失调、过劳过逸所致。中医学对DN病机的认识不一，但多数认为DN乃本虚标实之证。本虚多指气血阴阳不足及五脏亏虚;标实则指痰湿、浊毒、瘀血等病理产物堆积。李敬林教授结合其多年对DN的临床研究，认为早期DN患者乃脾肾亏虚、气阴两伤、痰湿浊毒、瘀血损伤肾络所致，故治疗以益气解毒活络立法，自拟YQJDHL中药复方，临床治疗DN疗效确切［4］。方中黄芪益气固表、利尿托毒、排脓敛疮生肌;黄精味甘、性平，益气养阴、健脾益肾、润心肺、强筋骨;黄连清热燥湿、泻火解毒;泽兰活血、通经、利尿，为治疗消渴瘀阻水停之良药;水蛭具有破血、逐瘀、通经之功效。上述药物巧妙组合，取其益气补肾、健脾润肺、清热解毒、活血通络之功，体现了中医学对DN“扶正祛邪、标本兼治”的治疗大法。

实验结果显示，应用具有益气健脾、祛痰解毒、活血通络作用的中药复方能够减轻肾脏肥大及肾小球系膜基质增生、硬化，早期应用作用尤为显著，表明益气解毒活络中药复方能够预防和治疗大鼠早期DN。本研究为临床应用益气解毒活络法防治DN提供了实验理论基础。

［1］付晓，李敬林.中医药综合治疗早期DN临床疗效观察类文献质量初步分析［J］.中国中医基础医学杂志，2011，17(4): 409-410.

［2］郑旭，罗杰，杨文英，等.一氧化氮在糖尿病肾病中的作用［J］.中华肾脏病杂志，1999，15(4):91-94.

［3］封翠云.DN的中医病名探讨［J］.国医论坛，2007，22(2): 22.

［4］李敬林，王东.从“脾主运化”论治消渴［J］.中国中医基础医学杂志，2002，8(12):43-44.

Effect of Yiqi Jiedu activating effects of Chinese medicine compound on the structure of kidney in diabetic rats

FU Xiao1，LI Jing-lin2
(1.Acupuncture and Moxibustion Department of the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning 121001，China;2.Geriatrics Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM，Shenyang，Liaoning 110032，China)

Objective:To investigate the effects of Yiqi Jiedu activating Chinese herbal compound(YQJDHL)on structure of kidney of experimental diabetes mellitus(DM)rats.Methods:72 SPF healthy male SD rats，each treatment group were injected STZ causing diabetes and phlegm，stasis and poison in syndrome model.Application of YQJDHL after DN model taking shape and taking shape for 2 weeks，low and high dose groups of traditional Chinese medicine and western medicine group were fed Chinese herbal compound.The pathological changes of rat kidney was observed.Results: YQJDHL can relieve diabetic nephropathy(DN)in the rat glomerular hypertrophy，glomerular mesangial cell proliferation and renal tubular epithelial cavity，such as Chinese medicine prevention treatment group is superior to the traditional Chinese medicine treatment group.Conclusion:YQJDHL can prevent and treat early DN rats，the mechanism may be related to delay the renal pathological tissue damage.

Yiqi Jiedu Huoluo Chinese herbal compound;Diabetic nephropathy;Rat

R255.4

B

1006-3250(2015)01-0047-03

2014-09-19

国家自然科学基金资助项目(30973778);辽宁省自然科学基金资助项目(2013022014)

付 晓(1974-)，女，锦州人，副主任医师，副教授，医学博士，从事中西医结合防治糖尿病及其慢性并发症的临床与研究。