缺氧对体外培养髓核细胞骨钙素水平的影响

吴源旻, 徐源俊, 王善金, 谭　军

(同济大学 东方医院,上海 200120)

缺氧对体外培养髓核细胞骨钙素水平的影响

吴源旻, 徐源俊, 王善金, 谭军

(同济大学 东方医院,上海 200120)

摘要:研究了缺氧对体外培养髓核细胞骨钙素表达的影响及意义.将人髓核细胞株进行体外培养,在显微镜下观察髓核细胞的生长形态;在传代培养 24、48、72 h时分别收集2组细胞,采用免疫组织化学SABC法检测骨钙素的表达,应用图像分析系统进行了半定量检测,光密度值显示:体外培养髓核细胞在 48、72 h时,缺氧组髓核细胞OCN表达水平均明显高于常氧组(平均光密度值分别为180.50±8.76 vs 169.29±3.04、190.87±7.06 vs 166.33±4.44,均P<0.01),且缺氧组髓核细胞骨钙素表达水平随缺氧时间延长而逐渐升高.常氧组各时间段之间髓核细胞骨钙素表达水平无统计学差异.缺氧可诱导髓核细胞骨钙素的表达上调,缺氧环境下髓核细胞的骨钙素过表达,缺氧可能对椎间盘软骨终板矿化起到促进作用.

关键词:髓核细胞; 骨钙素; 缺氧; 免疫组化

椎间盘由髓核、纤维环和软骨终板3 部分组成,是人体中最大的无血管组织.四岁时椎间盘就几乎没有任何血管,间盘营养严重减少,髓核细胞群随之发生明显变化,脊索细胞被更多的能适应无氧环境的软骨细胞和纤维母细胞所代替;十岁时颈椎间盘已经成为一个无血管的组织,其营养供应主要来自于软骨终板的渗透.软骨终板中央部分渗透性较周围部分高.软骨终板中央部分有1/3区域可以渗透,而周围部分仅约1/10 区域可以渗透;软骨终板在髓核处溶质渗透占整个软骨终板的85%,在软骨终板接近内呈纤维环处下降到35%,在软骨终板接近外层纤维环界面处几乎完全不能渗透.椎间盘营养通路主要有终板途径和纤维环途径:椎体内的血管不断分支,在软骨终板下骨质形成血管袢,包括氧气在内的绝大部分营养物质通过这些血管袢经扩散作用透过软骨终板、椎间盘基质,最终到达内部的椎间盘细胞,而乳酸等代谢废物经过相反途径排出,此即终板途径,Du 等通过动态增强MRI 清楚观察到这一现象[1];小部分营养物质通过分布到最外层纤维环的血管末梢来提供养分,即纤维环途径[2-3].但随着机体的老化,供应椎间盘周围的血管数量减少,软骨终板逐渐钙化,氧气等营养物质的供应及代谢废物的排除受到阻滞,椎间盘内逐渐形成缺氧微环境.这种微环境对椎间盘退变的发生发展如何产生影响,椎间盘退变是否与缺氧环境有关,这些都成为近年来学者们研究的重要课题.骨钙素是骨转化的重要指标,能反应骨质疏松的状况[4].最近研究发现骨钙素参与诱导椎间盘软骨终板的退变钙化过程,影响椎间盘退变[5].本实验拟通过体外培养髓核细胞,应用免疫学及组织化学原理,对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究,判断缺氧环境是否是骨钙素(OCN)变化的因素.

1材料与方法

1.1　主要试剂和仪器

永生化人髓核细胞株(上海拜力生物),基础培养箱,HF100三气培养箱,骨钙素(OCN)检测试剂盒(一抗,二抗,中杉金桥公司),磷酸盐缓冲液(PBS),4%多聚甲醛试剂,曲拉通X-100,H2O2溶液,牛血清白蛋白(BSA),DAB显色试剂盒,CKX31-A12PHP 倒置显微镜(Olympus 公司).

1.2　免疫细胞化学染色检测髓核细胞常氧与需氧下OCN表达,采用免疫组织化学SABC法

制作髓核细胞爬片,于37℃常氧培养箱,和模仿椎间盘缺氧(3% O2)条件的培养箱中培养;于规定时间节点取出细胞爬片,PBS缓慢洗涤3次,每次5 min,室温干燥;4%多聚甲醛固定20 min,PBS缓慢洗涤3次,每次5 min;3%Triton-100处理20 min,PBS缓慢洗涤3次,每次5 min;3%H2O2处理15 min,PBS缓慢洗涤3次,每次5 min;山羊血清或者BSA封闭2 h,PBS缓慢洗涤3次,每次5 min;一抗(兔抗人 OCN单抗(1∶200))4℃过夜封闭; 将玻片从4℃取出,室温复温30 min,PBS缓慢洗涤3次,每次5 min;室温孵育二抗(生物素标记的羊抗兔 IgG 抗体),结合2 h,PBS缓慢洗涤3次,每次5 min;三抗(SABC)封闭,室温下结合2 h,PBS缓慢洗涤3次,每次5 min;DAB显色3~10 min,待细胞出现特异性染色后用水洗涤,镜检;盐酸乙醇分化,氨水反蓝,镜检;脱水,封闭;拍摄,细胞核均染为蓝色,OCN表达阳性细胞胞质均染为棕色.

1.3　免疫组化图像分析

用Image-Pro Plus(IPP)6.0 分析免疫组化图片,根据染色染料颜色的深浅(光密度)及分布面积大小来确定目标蛋白的量.染色区域分布面积与目标蛋白量成正比.染色的颜色深浅(光密度)与目标蛋白量的定量关系符合朗伯-比尔定律,是对数关系.每张切片在高倍镜下(×100)随机选取8 个视野,应用图像分析系统进行半定量检测,结果以平均灰度值表示.平均灰度值高(染色强度弱、透光度强)表示OCN表达水平低;反之则表示表达水平高.平均光密度OD值(吸收光的物质的光学密度,与染色物质的量相关)高,表示OCN表达水平高;反之则表示表达水平低.将图片上各点的光密度值累加起来,得到IOD.此值与目标物质的总量成正比.IOD值除以细胞个数,得到单个细胞的mean density,此值反映了单个细胞OCN表达的水平.

1.4　统计学处理

应用 SPSS 19.0 统计学软件进行数据处理.检测数据以m±s表示,组间比较采用单因素方差分析 Tamhane′s T2检验,以P<0.01 为差异有统计学意义.

2结果

2.1　生长曲线分析

检测结果见图1~2在培养 48、72 h 时,缺氧组髓核细胞较常氧组细胞增殖速度减缓>40%.

2.2　常氧与需氧环境中髓核细胞OCN的表达髓核细胞OCN的表达

检测结果见图3~4和表1.

缺氧组与常氧组均可见OCN表达阳性细胞,且与常氧组比较,缺氧组多数阳性细胞的细胞质染色较深.在培养24 h时,缺氧组髓核细胞OCN表达水平与常氧组比较,差异无统计学意义.在培养48、72 h时,缺氧组髓核细胞OCN表达水平均明显高于常氧组(P<0.01),且缺氧组髓核细胞OCN表达水平随缺氧时间延长而逐渐升高(P<0.01),常氧组各时间段之间髓核细胞OCN表达水平无统计学差异.

3讨论

近年来在椎间盘组织工程及生物学研究方面取得的进展,为椎间盘退行性变的生物学治疗提供了较好前景.大量的研究表明,OCN 参与了椎间盘软骨终板的退变钙化过程,OCN 敲除可能抑制软骨终板的退变钙化[6].Idelevich 等研究证实OCN 过表达能促进血管平滑肌细胞和软骨细胞株的分化及矿化[7],而OCN siRNA 能抑制主动脉血管的骨化和矿化[8].

本实验在体外成功构建了人髓核细胞缺氧模型,通过免疫组织化学方法,对不同缺氧时期OCN在体外培养髓核细胞中的表达进行定量检测,结果显示在培养48、72 h时,缺氧组髓核细胞OCN表达水平均明显高于常氧组(P<0.01),且缺氧组髓核细胞OCN表达水平随缺氧时间延长而逐渐升高,说明缺氧可诱导髓核细胞OCN的表达上调,缺氧环境下髓核细胞的骨钙素过表达,这个结果也可以间接说明缺氧可能对椎间盘软骨终板矿化起到促进作用.

本实验有助于进一步揭示椎间盘退变的病理机制,为椎间盘退变的防治开辟新思路与新途径.

参考文献:

[1]DU H,MA S H,GUAN M,et al.Dynamic contrast enhancedmagnetic resonance imaging study of the nutrition pathway for lumbar intervertebral disk cartilage of normal goats[J].Orthop Surg,2011,3(2):106-112.

[2]GRUNHAGEN T,SHIRAZI-ADL A,FAIRBANK J C,et al.Intervertebral disk nutrition:a review of factors influencing concentrations of nutrients and metabolites[J].Orthop Clin North Am,2011,42(4):465-477.

[3]URBAN J P,SMITH S,FAIRBANK J C.Nutrition of the intervertebral disc[J].Spine,2004,29(23):2700-2709.

[4]SCHAFER A L,SELLMEYER D E,SCHWARTZ A V,et al.Change in undercarboxylated osteocalcin is associated with changes in body weight,fat mass,and adiponectin:parathyroid hormone(1-84)or alendronate therapy in postmenopausal women with osteoporosis(the PaTH study)[J].J Clin Endocrinol Metab,2011,96(12):1982-1989.

[5]ZHANG Z M,JIANG L S,JIANG S D,et al.Differential articular calcified cartilage and subchondral bone in postmenopausal women with osteoarthritis and osteoporosis:two-dimensional analysis[J].Joint Bone Spine,2009,76(6):674-679.

[6]NG K W.Regulation of glucose metabolism and the skeleton[J].Clin Endocrinol(Oxf),2011,75(2):147-155.

[7]IDELEVICH A,RAIS Y,MONSONEGO-ORNAN E.Bone Gla protein increases HIF-1alpha-dependent glucose metabolism and induces cartilage and vascular calcification[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(9):55-71.

(责任编辑：顾浩然)

[8]DUCY P,DESBOIS C,BOYCE B,et al.Increased bone formation in osteocalcin-deficient mice[J].Nature,1996,382(6590):448-452.GUAN M,et al.Dynamic contrast enhancedmagnetic resonance imaging study of the nutrition pathway for lumbar intervertebral disk cartilage of normal goats[J].Orthop Surg,2011,3(2):106-112.

Study on the effeets of hypoxia on the level ofOCN in nucleus pulposus cellsWU Yuanmin, XU Yuanjun, WANG Shanjin, TAN Jun

(Dongfang Hospital,Tongji University,Shanghai 200120,China)

Abstract:In order to studing the effects of hypoxia on the level of OCN in nucleus pulposus cells.Human nucleus pulposus cell were line cultured in vitro.The growth morphological of nucleus pulposus cells were observed under a microscope.Two groups of cells were collected respectively from 24,48,72 h in culture.Immunohistochemical SABC method was used in the OCN expression.Then IPP image analysis system was used in the semi quantitative detection results of which were expressed by optical density value.Results suggested that expression of hypoxia group of nucleus pulposus cells OCN levels were significantly higher than the normal oxygen group at 48,72 h in vitro.The average optical density values were 180.50+8.76 vs 169.29+3.04,190.87+7.06 vs 166.33+4.44,P<0.01.Hypoxia group of nucleus pulposus cells OCN level increased steadily with hypoxia time(P<0.01).There is no significant difference on between different time groups the expression level of OCN in normal oxygen nucleus pulposus cells OCN between each time group.Hypoxia can induce nucleus pulposus cells overexpress OCN.Hypoxia may contribute to intervertebral disc endplate cartilage mineralization.

Key words:nucleus pulposus cells; hypoxia; OCN; immunohistochemistry

通信作者:谭军,中国上海市浦东新区即墨路150号,同济大学附属东方医院脊柱外科,邮编:200120,E-mail:dr.tan@139.com;王善金,中国上海市浦东新区即墨路150号,同济大学附属东方医院脊柱外科,邮编:200120,E-mail:kingspine@163.com

基金项目:同济大学青年优秀人才培养行动计划(2013KJ075);国家自然科学基金青年基金(81201418);浦东新区卫生系统重点学科建设资助

收稿日期:2015-03-01

中图分类号:Q 253

文献标志码:A

文章编号:1000-5137(2015)02-0154-04