电子自旋共振技术(ESR)对鱿鱼氧化三甲胺热促分解机理研究

陈 帅，赵延敏

( 1. 浙江育英职业技术学院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大学，浙江 杭州 310035 )

科技与应用

电子自旋共振技术(ESR)对鱿鱼氧化三甲胺热促分解机理研究

陈 帅1，赵延敏2

( 1. 浙江育英职业技术学院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大学，浙江 杭州 310035 )

利用电子自旋共振技术(ESR)从自由基的角度探究鱿鱼高温氧化三甲胺(TMAO)热分解的刺激因子的热促分解机理，发现高温条件下氨基酸和还原糖能明显促进鱿鱼中TMAO的热分解，其中赖氨酸(Lys)和半乳糖(Gal)促进作用最强，且鱿鱼上清和TMAO- Fe(II)在高温条件下形成相似的自由基六重峰信号，Lys或Gal均能使鱿鱼上清中自由基信号增强，判定Lys和Gal通过增强-(CH3)3N·信号促进TMAO热分解产生FA。

鱿鱼；氧化三甲胺；甲醛；ESR

鱿鱼丝、烤鱿鱼片等鱿鱼制品因营养丰富、口味独特、食用方便而深受广大消费者欢迎。然而，鱿鱼制品中高含量内源性甲醛(Formaldehyde，FA)给产品品质和食用安全带来了负面的影响[1]。因此，探究鱿鱼制品中内源性FA的高温产生机理 已是当务之急。研究已表明，水产品内源性FA的前体物质是氧化三甲胺(Trimethylamine-n-oxide, TMAO)。在加工过程中受到蒸煮、烘烤等高温加热工艺，TMAO热分解产生FA、二甲胺(Dimethylamine, DMA)和三甲胺(Trimethylamine, TMA]。[1]Lin等发现5种鱿鱼在200°C 加热 1h 90%的TMAO热分解生成DMA和TMA。[2]Spinelli等报道鱼体组织中的Fe2+, Sn2+, SO2和 半胱氨酸的代谢产物能显著促进TMAO的非酶分解。[3]李丰等[4]在研究乳糖与TMAO的作用时，发现随着乳糖用量增加和温度升高，DMA、TMA和半乳糖的生成量增多。李薇霞等[5]在研究奶糖中FA的产生来源，发现FA产生与美拉德反应中的Strecher降解有关。可见，鱿鱼中刺激TMAO分解生成DMA和FA的关键内源性促进因子，可能与氨基酸和还原糖等有关。

此外，Ferris等在研究Fe2+对TMAO热解的脱烷基作用时发现，真正起到促进其热解作用产生FA的是Fe2+而不是Fe3+，而且主要是通过自由基(CH3)3N·的途径来完成的，反应过程如下：

(CH3)3NOH+Fe2+→(CH3)3N·+Fe3++H2O

(CH3)3N·+Fe2+→(CH3)3NH+Fe3+

(CH3)3N·+Fe3+→ (CH3)2N=CH2+H++Fe2+

+

H2O

↓

(CH3)2NH2+CH2O[6]

自由基的存在能大大加大化学反应的进程，导致细胞衰老及各种疾病的发生，而电子自旋共振技术(Electron spin resonance，ESR)广泛的应用于微量有基自由基的检测，如检测生物系统中HO·信号[7,8]，Steven等利用ESR技术检测二甲亚砜被HO·氧化时产生的·CH3[9]；Ch. Kroll等利用ESR技术检测生物医药品种硝酰基自由基[10]；贾佳在研究鱿鱼上清、鳕鱼上清的自由基时，分别以PBN和DMPO作为捕获剂，利用电子自旋共振技术(ESR)在加热后的鱿鱼上清捕捉到明显的六重峰，而且在TMAO-Fe2+体系中也检测到相同的六重峰，从而推测得到的六重峰为-(CH3)3N·[11]；苗林林利用ESR技术，使用不同捕获剂捕获到类似的九重峰信号[12]，因此，推测鱿鱼中TMAO热分解的一条可能途径是通过-(CH3)3N·自由基来完成的。

本研究发现鱿鱼中TMAO热分解产生FA、DMA和TMA的现象与氨基酸和还原糖变化有一定关联；通过氨基酸和还原糖的体外添加试验，筛选出促进鱿鱼上清、TMAO和TMAO-Fe(II)体系甲醛生成的因子赖氨酸和半乳糖，并从自由基角度阐述其促进机理。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

鱿鱼，浙江兴业集团有限公司；TMAO、TMA、DMA纯度98%，美国SIGMA公司；葡萄糖、半乳糖和乳糖，分析纯，成都科龙化工试剂厂；HNO3，色谱纯，上海阿拉丁试剂；三氯乙酸，纯度99.5%，上海阿拉丁试剂；甲醇、乙腈，99.9%，美国TEDIA公司；甲醛标准溶液100mg/L，国家环保总局。

1.2 主要试验仪器

ICS-1500离子色谱仪，美国戴安公司；HPLC1100高效液相色谱配有Agilent ODS2-C18 柱及紫外检测器，美国Agilent公司；SIGMA3-30K冷冻高速离心机，SIGMA公司；AB-135-S电子天平，梅特勒-托利多公司；PHS-3C pH计，上海精密科学仪器有限公司；Milli-Q Century超纯水系统，美国密理博。

1.3 鱿鱼上清制备

冷冻鱿鱼室温解冻后，将鱼肉切小块捣碎，取一定量碎鱿鱼，以1：2(g:V)与Tris-乙酸缓冲液(pH 7.0)混合，匀浆，离心(3000 g，12 min)，取上清液，沉淀以1：1缓冲液混合，匀浆，重复2次，上清(即提取的鱿鱼上清)混合，4℃冷藏备用。

1.4 样品处理

取鱿鱼肉在100℃沸水浴中处理30min，冷却，加入1ml 7.5%TCA，离心，取上清，测定TMAO、TMA、DMA、FA和还原糖含量。配置20mM TMAO和20mM TMAO-20mM Fe(II)的体外反应体系，7种还原糖对鱿鱼上清、TMAO和TMAO-M Fe(II)体系FA生成的影响，具体处理方法是：分别取7中还原糖与鱿鱼上清、TMAO和TMAO-Fe(II)进行等体积混合，还原糖作用浓度分别为20mM和200mM，以超纯水为空白对照，于100℃反应30min，同上处理后，测定FA含量。

1.5 TMAO、TMA、DMA和甲醛的检测方法

采用离子色谱法测定样品氧化三甲胺、三甲胺和二甲胺的含量[4]，参考李薇霞等[5]高效液相色谱法测定甲醛含量。

1.6 ESR检测自由基

将0.5mL样品置于2mL离心管，于100℃水浴15min，促使自由基产生，加入15mg PBN混匀，并于60℃保温1h，取样测定。ESR测定条件：室温，中心磁场为3512.00G，微波功率为6.35mw，调制频率为100GHz，调制幅度为2.00G，扫描40.96sec[11]。

1.7 数据处理

试验重复3次，结果以均值±标准偏差(Mean±SD)表达。采用Origin 8.0进行作图，SPSS软件单因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)用来比较各组间的差异，P<0.05 表示差异性显著。

2 结果与分析

2.1 高温处理对鱿鱼肌肉和鱿鱼上清TMAO热分解的影响

注：同一行中数据右上角字母不同表示显著差异(P<0.05)。

鱿鱼肌肉和鱿鱼上清经100℃加热处理30min后，FA、DMA、TMA和TMAO含量变化如表1所示。高温对鱿鱼肌肉和上清TMAO表现出相似的分解规律，TMAO含量表现显著下降(P<0.05)，相应的FA、DMA含量显著上升(P<0.05)，鱿鱼上清中TMA的变化较小，这与鱿鱼肌肉中可能存在其他的促进TMA形成因素有关，如酶等。研究已表明，在高温加热过程中阿根廷和北太鱿鱼胴体中TMAO分解为TMA、DMA和FA。[2,3]李薇霞等[5]在研究奶糖中FA的产生来源，发现FA产生与美拉德反应有关。由于高温过程中可能存在美拉德反应，因此推测甲醛产生可能与外源添加氨基酸和还原糖有关。

2.2 氨基酸、还原糖对鱿鱼上清和TMAO-Fe(II)水溶液中FA形成的影响

注：各组因素同一列中数据右上角字母不同表示显著差异(P<0.05)；

分别研究3种氨基酸和3种还原糖对鱿鱼上清及TMAO-Fe(II)模拟体系高温FA生成的影响如表2所示。结果可见，经过100℃处理30min后，鱿鱼上清和TMAO-Fe(II)模拟体系甲醛生成明显。其中赖氨酸和半乳糖能明显提高甲醛的含量，分别由17.8 mg/L、8.82 mg/L上升至117.30mg/L、32.47 mg/L，而葡萄糖、乳糖、甘氨酸虽能促进TMAO-Fe(II)模拟体系中FA的产生，但对鱿鱼上清的促进作用不明显。高浓度的半胱氨酸反而能抑制FA的产生，这可能是因为半胱氨酸与生成的FA结合。

2.3 ESR检测TMAO和TMAO-Fe(II)中自由基信号

分别将TMAO标准品、TMAO+2mM Fe(II) 和TMAO+20mM Fe(II) 100℃加热处理15min，其自由基信号如图1所示，TMAO标准品中加入Fe2+能够明显提高自由基信号的强度，而且自由基信号为六重峰，当Fe2+浓度由2mM增加至20mM时，自由基信号强度明显增强，由300000增加至1750000。J P Ferris等[6]发现Fe2+对TMAO的脱烷基化作用是通过-(CH3)3N·自由基产生甲醛，因此，此自由基信号应为-(CH3)3N·自由基。

2.4 ESR检测加热处理后鱿鱼上清、鱿鱼上清-Lys/Gal中自由基信号

在同样的ESR测定条件下，分别对鱿鱼上清、鱿鱼上清+赖氨酸和鱿鱼上清+半乳糖的自由基进行检测，测定结果如上图所示，加热处理过的鱿鱼上清产生了与TMAO-Fe(II)体系相同的明显的六重峰自由基信号，强度为200000以上 ，因此鱿鱼上清中FA的产生同样是通过-(CH3)3N·，添加赖氨酸或半乳糖后-(CH3)3N·信号强度增强，到达400000，因此可以判定赖氨酸和半乳糖的促进机理与Fe2+对TMAO的脱烷基化作用相同，都是通过-(CH3)3N·完成。

3 结论

鱿鱼中氧化三甲胺高温热分解能产生甲醛、二甲胺和三甲胺，美拉德反应能促进TMAO热分解，其中以赖氨酸和半乳糖促进作用最强，而且其热促反应机理与Fe2+对TMAO的脱烷基化作用相同，均是以提高-(CH3)3N·自由基的强度进行的。

[1]Zhu, J. L., Li, J. R., & Jia, J. (2012). Effects of thermal process and various chemical substances on formaldehyde and dimethylamine formation in squid Dosidicus gigas[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 92, 2436-2442.

[2]Lin, J. K., & Hurng, D. C. (1985). Thermal conversion of trimethylamine-N-oxide to trimethylamine and dimethylamine in squids[J].Food and Chemical Toxicology, 23, 579 -583.

[3]Spinelli, J., & Koury, B. (1979). Nonenzymic formation of dimethylamine in dried fishery products[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 27, 1104-1108.

[4] 李丰. 水产品中氧化三甲胺、三甲胺、二甲胺检测方法及鱿鱼丝中甲醛控制研究[D]. 保定: 河北农业大学, 2010:1-50.

[5] 李薇霞. 奶糖中内源性甲醛生成机理研究[D]. 杭州: 浙江工商大学, 2012:1-56.

[6] J P Ferris, R D Gerwe, G R Gapski. Detoxication Mechanisms.II.The Iron-Catalyzed Dealkylation of Trimethylamine Oxide[J]. Journal of the American Chemical Society, 1967, 89(27):5270-5275.

[7]王炳娟, 卢青, 邹洪. 气相色谱法测定Fenton反应产生的羟基自由基及其清除作用[J]. 理化检验-化学分册, 2009, 45(1):88-90.

[8]李崎, 严敏, 李永仙等. 利用电子自旋共振(ESR)技术研究啤酒原辅料自由基及其对麦汁自由基的影响[J]. 分析试验室, 2007, 26(5):85-90.

[9]Steven Yue Qian, Maria B. Kadiiska, Qiong Guo, et al. A novel protocol to identify and quantify all spin trapped free radicals from in vitro/in vivo interaction of HO? and DMSO: LC/ESR, LC/MS,and dual spin trapping combinations[J]. Free Radical Biology & Medicine, 2005, 38:125-135.

[10]Ch. Kroll, K-H Schwarz, P Surmann, H-H Borchert. Differential pulse polarography and electron spin resonance spectroscopy of nitroxyl free radicals used as ESR-spin probes[J]. Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 1999, 48:233-236.

[11]贾佳. 秘鲁鱿鱼中氧化三甲胺热分解生成甲醛和二甲胺机理的初步研究[D]. 杭州: 浙江工商大学, 2009:6-61.

[12]苗林林. 秘鲁鱿鱼复合甲醛抑制剂的研发及其应用[D]. 杭州: 浙江工商大学, 2011: 1-56.

(责任编辑：孙强)

Study on the Thermal Degradation of TMAO in Squid by Electron Spin Resonance(ESR)

CHEN Shuai1,ZHAO Yan-min2

( 1.Zhejiang Yuying Collage of Vocational Technology, Hangzhou, Zhejiang 310018, China;2. Zhejiang Gongshang University, Hangzhou, Zhejiang 310035, China )

To assess the stimulatory factor of TMAO breakdown, the influence of reducing sugar to the thermal conversion of trimethymine-N-Oxide (TMAO) to formaldehyde (FA) in squid was studied. It showed that the correlation of decomposition of TMAO and reducing sugar was observed. The galactose exhibited the strongest stimulatory factor in formation of FA in the squid extract and TMAO aqueous solution. The similar promotion of the degradation of TMAO to FA, DMA and TMA was observed in two systems. The addition of Lys and Gal enhanced greatly the signal intensity in the squid extract. Therefore, Lys and Gal could promote the conversion of TMAO to FA by enhancing the signal strength of -(CH3)3N· in squid.

squid; trimethymine-N-Oxide (TMAO); galactose; formaldehyde (FA); ESR

2014-09-01

浙江育英职业技术学院校级课题(YYFW1301)

陈帅(1987- )，女，山东潍坊人，硕士，食品教研室助教。

TS207.4

A

1671-4385(2015)01-0089-04