近期色谱研究的最新动态和进展

白 泉

(西北大学现代分离科学研究所, 现代分离科学陕西省重点实验室, 陕西 西安 710069)

聚 焦

近期色谱研究的最新动态和进展

白 泉*

(西北大学现代分离科学研究所, 现代分离科学陕西省重点实验室, 陕西 西安 710069)

色谱是复杂样品分离分析的重要手段。当前复杂样品的分析对分离科学提出了越来越高的要求,而发展新型高效分离材料、分离模式和高灵敏度的检测方法是解决该问题的有效途径之一。本文依据2015年6至8月AnalyticalChemistry新录用和在线发表的有关论文,讨论色谱在样品前处理、固定相、手性拆分、分析检测、蛋白质组学等方面的最新研究动态和进展。

1 样品前处理

样品前处理是分析过程的关键环节,直接影响着分析结果的准确度和精密度。膜蛋白的疏水性强、溶解性差和丰度低,对它的分离分析是蛋白质组学中的一大难题。复旦大学的刘宝红教授课题组[1]采用壳聚糖改性的介孔泡沫石墨烯(MGF-CS)作为纳米反应器，从有机溶剂中高效富集疏水性膜蛋白并进行原位酶解。将该技术应用于实际样品中膜蛋白的分析鉴定,采用二维液相色谱-质谱方法(2D-LC-MS)可鉴定931种膜蛋白,而通常采用的水溶液中酶解法仅能鉴定73种膜蛋白。结果表明多功能的MGF-CS对蛋白质组学中膜蛋白的分析鉴定具有重要的应用价值。

分子印迹技术是采用人工合成方法制备对目标分子有特异性识别材料的技术。目前针对有机小分子和金属离子的印迹工作已取得了巨大进展。由于蛋白质体积大、结构复杂、易于变性,完整蛋白质模板分子难以获得且价格昂贵,因此限制了蛋白质分子印迹材料的发展。中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员课题组[2]提出了一种蛋白质抗原决定基分子印迹磁性纳米材料的制备新方法。抗原决定基印迹是以目标蛋白质上一段特异性多肽为模板分子进行印迹。由于模板肽段与目标蛋白质间存在极强的特异性,形成的印迹位点对模板肽段及目标蛋白质均具有特异性识别能力。首先在SiO2包覆的磁性Fe3O4纳米粒子表面通过化学修饰引入亚氨基二乙酸(IDA)基团。利用IDA与Ni2+的螯合作用,将Ni2+固载在基质材料(Fe3O4@SiO2@IDA@Ni2+)表面;然后加入末端修饰有组氨酸标签的模板肽段溶液,使模板通过与Ni2+的螯合作用固载于基质表面;随后按一定的质量比在上述固载模板的基质材料中加入功能单体多巴胺,在弱碱性条件下进行自聚合形成分子印迹层,制备出核-壳型复合纳米粒子,可通过单体的用量控制壳层厚度;聚合完成后,反复用200 mmol/L EDTA-2Na水溶液清洗聚合物材料,使其中的模板分子洗脱出来,进而得到抗原决定基分子印迹材料。该表面分子印迹纳米材料对目标蛋白质具有很好的选择性识别作用。该制备方法不仅解决了蛋白质分子印迹中蛋白质难以获得、价格昂贵的问题,同时多肽模板构象稳定,增加了印迹位点识别的特异性。通过金属螯合作用将模板多肽固载于基质表面,大大提高了模板的利用率。该方法对制备不同目标蛋白质抗原决定基印迹材料具有通用性和普适性。

金属有机骨架化合物(metal-organic frameworks, MOFs)因具有比表面积大、结构多样性、孔道尺寸可调、骨架可修饰、热稳定性和化学稳定性良好等优点而广泛应用于分离分析等领域。西班牙Balearic Islands大学的Palomino课题组[3]利用注射器设计了一种针管式自动磁性MOFs分散固相微萃取装置。首先将10 mg磁性MOFs材料Fe3O4@MIL-100(Cr)和一个磁子置于5 mL针管内。该针管类似于一个双向的注射泵。以高流速将样品溶液从针头处加入针管内,使MOFs材料完全分散于样品溶液中。在搅拌过程中选择性吸附样品的磁性MOFs纳米颗粒逐渐吸附于磁子上。可以通过控制磁子的磁性释放和回收磁性MOFs纳米粒子。待吸附完全,推动注射器的活塞杆将溶液挤出。再按上述方法用水多次充分洗涤MOFs纳米吸附剂,最后用洗脱剂洗脱样品后进行检测。该装置设计巧妙,简单易行,便于与检测器或分离装置连接。将其应用于各种水样和鱼样中孔雀石绿的分析检测,检出限达到0.012 mg/L,线性范围为0.04～2 mg/L。

澳大利亚Bahauddin Zakariya大学的Najiam-ul-Haq课题组[4]构建了一种磁性氧化镧和氧化钐核-壳纳米粒子(Fe3O4@SiO2-La2O3和Fe3O4@SiO2-Sm2O3),成功地用于各种酪蛋白、脱脂牛奶、蛋黄、人血清和Hela细胞提取物中磷酸化肽和磷酸化蛋白质的富集。该吸附材料几乎没有不可逆吸附,在8 500倍的非磷酸化蛋白质牛血清白蛋白(BSA)背景溶液中对β-酪蛋白仍表现出了非常高的选择性,灵敏度可达到attomole (10-18mol)级,重现性好,在磷酸化蛋白质组学中具有很好的应用前景。

2 固定相

多孔整体材料作为一种新型分离介质,由于其具有制备简便、通透性好、性能稳定和易于修饰等特点而被誉为第四代色谱分离介质。邹汉法课题组[5]发展了一种基于光引发巯基-丙烯酸酯点击聚合反应的新方法,并成功制备了具有高分离性能的有机-硅胶杂化整体柱。与巯基-烯和巯基-甲基丙烯酸酯点击聚合反应相似,光引发的巯基-丙烯酸酯点击聚合反应不仅反应效率较高,速度快(通常10 min内即可完成),而且反应条件非常温和。所制备的有机-硅胶杂化整体柱的微观结构非常均一、规整,并且具有较高的机械强度、热稳定性和化学稳定性。将其应用于毛细管液相色谱,柱效高达73 500 N/m,实现了对苯系物、苯酚类、苯胺类等小分子化合物的高效分离。此外,所制备的整体柱对16种多环芳烃PAHs混合标准物(EPA 610)和蛋白质酶解液等一些复杂的环境和生物样品也具有较好的分离能力。表明采用巯基-丙烯酸酯点击聚合反应可以有效制备出具有高效分离能力的新型毛细管有机-硅胶杂化整体柱。

加拿大卡尔加里大学的Thurbide小组[6]将316不锈钢粉末(粒径44～149 μm)填充于316不锈钢毛细管柱内作为支持体,将水泵入色谱柱中,建立了以水为固定相,CO2为流动相,与火焰离子化检测器联用的超临界流体色谱分离体系(SFC-FID)。该体系可在一定的温度和压力范围内进行操作。样品保留时间的重现性良好(RSD≤2.6%)。与不锈钢毛细管直接用水涂层作为固定相相比,这种用不锈钢粉末填充柱的方法不仅可以保持良好的色谱峰形和高柱效,还可使分离速度提高10倍,保留因子提高约8倍,样品量提高20倍。

3 手性拆分

德国莱比锡城大学的Belder小组[7]将纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)包覆的5 μm全多孔SiO2手性固定相填充于微流控芯片的通道中,第一次利用填充的微流控芯片(柱长58.4 mm)实现了几种手性药物的快速拆分,对力莫敌提取物在5 s内就可完成拆分。

法国Grenoble Alpes大学的Peyrin小组[8]利用毛细管电泳研究了任意选择的10种具有不同碱基组成、大小、长度和二级结构的寡核苷酸作为手性试剂时对手性化合物的拆分能力。作者采用将寡核苷酸部分填充于毛细管柱的方式,对24种手性化合物进行了拆分。研究结果表明所选择的寡核苷酸对芳香族小分子化合物都表现出了一定的手性拆分能力。在mmol/L DNA条件下,仅用3种寡核苷酸就可拆分包括药品、毒品、氨基酸和核苷等在内的21种芳香族手性化合物。这一研究结果表明发展基于核酸的手性拆分方法具有广阔的应用前景。

4 分析检测

澳大利亚悉尼大学的Handelsman小组[9]采用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯(1,2-dimethylimidazole-5-sulfonyl chloride)作为雌激素衍生化试剂,建立了一种利用LC-MS/MS同时测定血清中衍生化的雌二醇(E2)和未衍生化的睾酮(T)、二氢睾酮(DHT)的高灵敏检测方法。该衍生化试剂可与雌二醇的酚羟基反应,在质谱分析中可高灵敏度地检测到质量增加片段。E2、T和DHT的检出限分别为0.5 pg/mL、25 pg/mL和0.10 ng/mL。

随着纳米材料科学的发展,金属纳米粒子的检测引起相当大的关注。中国地质大学的Zhu等[10]采用一种耦合薄层色谱和激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(TCL-LA-ICP-MS)技术对水悬浮液中的纳米金进行定量表征分离。该方法已成功地应用于定量表征金纳米粒子大小(13、41和100 nm)的薄层色谱分离过程,实现了不同粒径纳米金的测定。

5 蛋白质组学

多维液相色谱(MDLC)为自上而下蛋白质组学研究中整体蛋白质的分离提供了有力工具。但是二维液相色谱(2DLC)却无法满足蛋白质组学复杂样品中整体蛋白质分离的需要。美国Wisconsin-Madison大学的Ge小组[11]耦合离子交换色谱/疏水色谱/反相色谱(IEC-HIC-RPC)3种色谱分离方法,构建了三维液相色谱(3DLC)用于整体蛋白质的分离,并证明3DLC(IEC-HIC-RPC)技术优于传统的2DLC(IEC-RPC)。对于HEK293细胞裂解液,前者可鉴定640种蛋白质,而后者只能鉴定出47种。结果表明3DLC技术在自上而下蛋白质组学中对整体蛋白质的分离具有很好的应用前景。

蛋白质的磷酸化一直是功能蛋白质组学研究的热点。美国PolyLC公司的Alpert等[12]比较了静电排斥亲水色谱(ERLIC)和阴离子交换色谱(AEX)两种分离模式在不同pH条件下对磷酸化肽分离的优劣。在pH>5时,磷酸化肽带有2个负电荷,可在AEX柱上保留,但是带有1个或2个磷酸基团的肽却无法与含有多个精氨酸和谷氨酸残基的多肽分离,从而干扰磷酸化肽的鉴定。在pH=2时,磷酸化残基仅带一个负电荷,而精氨酸和谷氨酸残基不带电荷,有利于磷酸化肽从未被修饰的酸性多肽中分离。在此条件下,单磷酸化肽基于静电排斥作用在ERLIC模式下有弱保留。比较AEX和ERLIC两种分离模式对Hela细胞胰蛋白酶酶解物的分离,ERLIC模式可分离鉴定12 467种磷酸化肽,其中包括4 233种多个磷酸修饰的肽段。而AEX模式只能鉴定其中的60%。研究结果表明,在低pH条件下,ERLIC模式是对磷酸化肽分离鉴定的最好方法,为磷酸化肽的分离鉴定提供了新思路。

[1] Fang X N, Qiao L, Yan G Q, et al. Anal Chem, 2015, 87: 9360

[2] Li S W, Yang K G, Liu J X, et al. Anal Chem, 2015, 87: 4617

[3] Maya F, Cabello C P, Estela J M, et al. Anal Chem, 2015, 87: 7545

[4] Jabeen F, Najam-ul-Haq M, Rainer M, et al. Anal Chem, 2015, 87: 4726

[5] Zhang H Y, Ou J J, Liu Z S, et al. Anal Chem, 2015, 87: 8789

[6] Murakami J N, Thurbide K B. Anal Chem, 2015, 87: 9429

[7] Thurmann S, Lotter C, Heiland J J, et al. Anal Chem, 2015, 87: 5568

[8] Tohala L, Oukacine F, Ravelet C, et al. Anal Chem, 2015, 87: 5491

[9] Keski-Rahkonen P, Desai R, Jimenez M, et al. Anal Chem, 2015, 87: 7180

[10] Yan N, Zhu Z L, Jin L L, et al. Anal Chem, 2015, 87: 6079

[11] Valeja S G, Xiu L C, Gregorich Z R, et al. Anal Chem, 2015, 87: 5363

[12] Alpert A J, Hudecz O, Mechtler K, et al. Anal Chem, 2015, 87: 4704

《色谱》主编张玉奎院士荣获色谱终生成就奖

9月22日,在北京召开的第43届国际高效液相色谱及相关技术会议(HPLC 2015, Beijing)上,经中国色谱学会推荐,HPLC科学委员会常委批准,大会向张玉奎院士颁发了色谱终生成就奖。

《色谱》主编张玉奎院士于1965年毕业于南开大学化学系,1965年至今在中国科学院大连化学物理研究所工作;兼任国家重点基础研究发展研究(973)领域咨询专家组成员、重大科学研究计划专家组成员、中国分析测试协会副理事长、中国化学会色谱专业委员会主任、Anal Chem等杂志编委;目前已发表SCI论文近500篇,并申请100余项发明专利;曾获国家自然科学二等奖、辽宁省自然科学一等奖等奖项。

张玉奎院士长期致力于色谱基本理论和新技术、新方法的研究,为推动色谱学科的发展做出了重要贡献,在色谱热力学、动力学和专家系统等方面均取得了突出成就;在深入理论研究的基础上,还注重完成国家任务与仪器的应用开发,实现了国内色谱仪器及相关部件的产业化;近年来,根据分析化学和国际前沿研究领域的发展趋势,结合国家重大应用领域的需求,放眼于分析学科与生命学科的交叉发展,着重开展蛋白质组高效分离与高灵敏检测的研究;在科学研究同时,坚持以人为本的原则,高度重视人才培养,目前已培养博士后和博士50余名,均已在我国分析科学领域基础研究、应用开发以及仪器产业化等方面发挥着重要的作用。

李潇、侯春彦 供稿

10.3724/SP.J.1123.2015.10006

2015-10-08

*通讯联系人.E-mail:baiquan@nwu.edu.cn.