草酸诱导紫花苜蓿对霜霉病的抗性

李克梅，张芯伪，王丽丽，先米西努尔·肉孜

(新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐830052)

苜蓿(Medicago sativa)属豆科苜蓿属多年生草本植物，由于其品质优良，适口性好，因此作为主要牧草被广泛种植［1］。苜蓿霜霉病是由苜蓿霜霉菌(Peronospora aestivalis)侵染引起的世界性病害，在我国发生普遍［2-3］，现已成为限制我国苜蓿生产的主要病害之一［4］。由于目前生产上对苜蓿霜霉病的防治存在缺乏抗病品种、农业防治周期长见效慢、化学防治的安全性堪忧等问题，因此，探索更为安全、高效的苜蓿霜霉病防治措施是当前苜蓿生产中急需解决的问题之一。植物诱导抗病性因其不污染环境、抗病周期长等特点，逐渐成为防治植物病害研究的热点，被当作是发掘植物内在抗性机制的一种全新的病害防治方法和措施［5-6］，王海华和康健［7］报道了国外已有将诱导因子应用于大田作物的尝试，并取得了良好的防治效果。国内针对植物诱导抗病性也开展了一系列研究，证明茉莉酸甲酯能诱导水稻(Oryza sativa)幼苗对白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)和水稻苗期细菌性条斑病(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)的抗性，并提高水稻相关防御酶的活性［8-9］;水杨酸处理可以改变人参(Panax ginseng)根部相关防御酶的活性，从而提高对人参锈腐病(Cylindrocarpon destructans)的抗性［10］;水杨酸对番木瓜环斑病毒病(Papaya Ringspot Virus，PRV)有很好的诱导防病效果［11］。上述研究成果也为苜蓿病害的防治打开了新思路［12］，故针对苜蓿霜霉病进行诱导抗性研究，对探索苜蓿病害防治新技术具有重要意义。目前，利用诱导抗病性防治植物病害的研究对象主要包括粮食、油料、瓜果、烟草(Nicotiana tabacum)等［13］作物，用在牧草病害防治方面的报道很少。

草酸(Oxalic Acid，OA)是一种有效的化学诱抗剂，它能显著提高植物对不同病菌的系统抗病性［14-18］，但草酸诱导苜蓿抗霜霉病的研究尚未见报道。本研究用苜蓿霜霉病菌接种预先经草酸处理过的苜蓿幼苗，测定草酸诱导苜蓿抗霜霉病的效果以及经草酸诱导后苜蓿幼苗叶片中过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化，旨在确定草酸诱导苜蓿抗霜霉病作用的安全使用量和持效期，为利用草酸防治苜蓿霜霉病提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植株及菌种 供试苜蓿品种为“新疆大叶”，由新疆农业大学草环学院育种基地提供。

供试苜蓿霜霉菌，采自田间自然发病植株，在20 ℃培养箱内水培备用［19］。

1.1.2 供试药剂及浓度 草酸为天津市福晨化学试剂厂生产，品质为分析纯。草酸用蒸馏水溶解，药液经细菌过滤器过滤。在前期预试验过程中，草酸浓度分别为1 和5 mmol·L－1时，诱导酶活性变化差异不显著，草酸浓度为50 mmol·L－1时，苜蓿苗叶片发黄，显示轻度药害症状，故将其稀释至供试浓度分别为10、20、30、40 mmol·L－1备用。

1.2 试验方法

1.2.1 苜蓿苗培养 参照孙涛等［4］的方法培养苜蓿苗，待真叶长至十叶期时接种。

1.2.2 草酸对苜蓿幼苗诱导抗病性测定 选择十叶期的苜蓿健康幼苗，配制不同浓度10、20、30、40 mmol·L－1的草酸溶液喷雾处理，以清水作对照。共喷药两次，间隔3 d，第2 次喷药3 d 后接种，每个处理重复3 次。苜蓿霜霉病菌的制备和接种方法参照李克梅等［19］的方法进行。孢子囊溶液配好后立即施用，均匀喷洒到健康苜蓿叶片的正反两面，先保湿暗培养24 h，然后在温度18 ～20 ℃、相对湿度60% ～80%、光照强度1 500 lx、日光照8 ～10 h 人工生长箱中培养。一周后采集所有叶片调查发病情况，根据苜蓿霜霉病的分级标准，统计病叶数，记录病叶症状反应级别，计算病情指数和诱抗效果。

1.2.3 苜蓿霜霉病严重度分级标准 0 级:无病斑;1 级:病斑面积小于叶片总面积的1/3;2 级:病斑面积大于叶片总面积的1/3，但小于2/3;3 级:病斑面积大于叶片总面积的2/3［20］。

1.2.4 苜蓿叶片内防御酶活性的测定 选用健康的苜蓿种子，消毒催芽播种于花盆内(每盆15 株)。方法同1.2.1。待苜蓿幼苗长到十叶期时，用草酸对苜蓿幼苗诱导抗病性测定试验中确定浓度的草酸溶液喷雾处理苜蓿植株，以叶片上均匀布满微小雾点为宜，以清水为对照。分别在经草酸溶液喷雾处理后的1、3、5、7 和9 d 测定苜蓿叶片中POD、PAL、SOD 的活性。每处理重复3 次。

POD 活性测定采用Ye 等［21］的方法;SOD 和PAL 活性测定采用汤章城［22］的方法。各样品测定3 次，3 个重复。以上方法均略有改动。

1.3 数据分析

所有试验数据均采用Excel 和DPS 7.05 软件处理。

2 结果与分析

2.1 不同浓度草酸对苜蓿幼苗抗霜霉病的诱抗效果

不同浓度草酸溶液处理的苜蓿植株与对照相比抗病性明显增强，在10 ～40 mmol·L－1草酸溶液诱导下，诱抗效果呈上升趋势(表1)。处理浓度为40 mmol·L－1时，诱抗效果可达50.8%。草酸浓度10、20、30 mmol·L－1之间诱抗效果均差异显著(P ＜0.05)，30 和40 mmol·L－1处理间的诱抗效果无显著差异(P ＞0.05)。当草酸浓度为40 mmol·L－1时，尽管其防治效果最好，但与30 mmol·L－1处理间无显著差异，从实用和经济角度考虑，选用30 mmol·L－1为诱导处理适宜浓度。因此，在苜蓿叶片防御酶活性测定中以30 mmol·L－1为处理浓度。

表1 草酸对苜蓿霜霉病的诱导抗病效果Table 1 Effects of alfalfa resistance against downy mildew induced by oxalic acid

2.2 草酸处理对苜蓿叶片防御酶活性的影响

2.2.1 草酸对过氧化物酶(POD)活性的影响 经30 mmol·L－1草酸溶液诱导处理后1 ～9 d 的苜蓿叶片的POD 活性均有提高，其活性呈先升后降的趋势，草酸诱导处理1、3、5、7 和9 d 后，苜蓿叶片组织内POD 活性分别为对照的1.04、1.26、1.59、1.18和1.27 倍。从诱导后1 d 开始，POD 活性持续升高，并 于 诱 导 处 理 后 5 d 达 到 最 大(8. 22 U·g－1·min－1)，而此时对照的POD 活性为5.16 U·g－1·min－1。之后酶活性开始下降，至诱导处理后9 d 时降至6.05 U·g－1·min－1，但仍显著高于对照(P ＜0.05)(图1)。

图1 草酸对苜蓿叶片POD 酶活性影响Fig.1 Effects of oxalic acid on alfalfa POD activity

2.2.2 草酸对苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响苜蓿叶片中PAL 活性在30 mmol·L－1草酸溶液诱导处理后1 ～9 d 均高于对照，分别为对照的1.05、1.08、1.39、1.31 和1.30 倍，且从3 d 开始均与对照差异显著(P ＜0.05)，至5 d 时达到最大值(5.64 U·g－1·h－1)，而此时对照的PAL 活性为4.06 U·g－1·h－1。之后PAL 活性开始下降，但7 d和9 d 时PAL 活性依然能分别达到4.91 和4.67 U·g－1·h－1，说明草酸诱导可使PAL 活性增强，且能持续到9 d(图2)。

2.2.3 草酸对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响经30 mmol·L－1草酸溶液诱导处理不同时间苜蓿叶片中SOD 活性均显著高于对照(P ＜0.05)，诱导处理1、3、5、7 和9 d 后，苜蓿叶片组织内SOD 活性分别为对照的1.10、1.56、1.29、1.37 和1.40 倍。诱导后3 d，苜蓿叶片组织内SOD 活性达到最大(642.47 U·g－1)，而此时对照的SOD 活性为412.15 U·g－1，处理5、7 和9 d 后的苜蓿叶片SOD活性略有下降，但均显著高于对照(P ＜0.05)(图3)。

图2 草酸对苜蓿叶片PAL 酶活性影响Fig.2 Effects of oxalic acid on alfalfa PAL activity

图3 草酸对苜蓿叶片SOD 酶活性影响Fig.3 Effects of oxalic acid on alfalfa SOD activity

3 讨论与结论

本试验结果表明，10 ～40 mmol·L－1草酸溶液均可降低苜蓿幼苗霜霉病的病情指数，且随草酸浓度增加诱抗效果呈上升趋势，但草酸浓度为30和40 mmol·L－1时，诱导防效无显著差异(P ＞0.05)，这说明诱导剂在一定浓度范围内可能与植物获得的诱导抗性程度呈正相关，但当诱导剂达到一定浓度后就可充分诱导植株体内相关防御机制的运转，之后并不随着诱导剂浓度增大而使植株诱导抗性继续增强。在植物的诱导抗病过程中伴随着一系列物质的代谢，其中关键因子就是催化这些反应的酶［12］。本试验中使用诱导剂草酸处理苜蓿幼苗后，叶片组织中POD、PAL、SOD 活性比清水处理均有不同程度的提高，表明外源草酸可提高苜蓿叶片相关防御酶活性，草酸诱导苜蓿对霜霉病抗性获得可能与相关防御酶活性的提高有关，此研究结果与在黄瓜(Cucumis sativus)［23］、油菜(Brassica campestris)［24］上的研究结果基本一致。另外，随着30 mmol·L－1草酸溶液处理时间的推移，3 种酶活性均高于清水对照，但总体呈现先升后降的趋势，可能是外源草酸激活了与POD、PAL、SOD 表达有关的信号分子，使其表达量上升到一定峰值，但随后可能随着草酸被消耗，相应的酶活性又逐渐降低，直至处理后9 d，活性仍然高于清水对照，说明草酸诱导的持效性大于9 d。

诱导抗性技术是植物病害防治的一条新途径，特别是对生产上缺乏抗病品种和有效的化学防治药剂或者不适合使用化学农药的植物病害尤为重要。在苜蓿病害防治中，由于化学农药的使用不利于绿色奶业的发展，故诱导抗性的研究可为寻找苜蓿病害安全防控新技术提供依据。草酸是一种有效的非生物诱导剂，应用外源草酸可显著降低林木炭疽病、西瓜花叶病毒病、油菜菌核病、黄瓜炭疽病、黄瓜霜霉病等病害的病情指数，提高植物对病害的抗性［23］。本研究结果证明，外源草酸能显著降低苜蓿霜霉病的病情指数，提高苜蓿对霜霉病的抗性，且抗性持效期至少在9 d。

本试验只针对苜蓿的单个病害进行了单一诱导剂诱导抗病，对于同一种诱导剂能否对苜蓿的其他病害产生诱导作用以及不同诱导剂组合使用效果如何等方面尚未涉及，有待进一步研究。

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