盐渍青菜真菌菌群结构DGGE分析及酵母菌分离鉴定*

尹礼国，马伟玲，李文芳，杨婧，梁会朋，张其圣，，陈功，吴正云，张文学

1(宜宾学院 生命科学与食品工程学院，四川 宜宾，644007)

2(四川大学 轻纺与食品学院，四川成都，610065)

3(宜宾学院固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川宜宾，644007)

4(四川省食品发酵工业研究设计院，四川成都，611130)

国内外学者对发酵蔬菜的微生物生态研究表明，乳酸菌、酵母菌是发酵蔬菜中的优势菌群，乳酸菌通过产酸降低pH值，抑制腐败微生物的生长，酵母菌在发酵过程中会产生乙醇、酯类等物质，可赋予发酵蔬菜良好的风味。张鹏［1］、鄯晋晓［2］、曾骏［3］等开展了泡菜增香酵母菌的分离、鉴定及应用。罗松明等［4］采用微生物培养技术对四川地区16份企业盐渍水样品微生态研究表明，大多数泡菜样品的酵母菌含量为103～106CFU/mL。传统分离培养技术能获得的微生物仅占自然界微生物的1% ～10%，操作步骤繁琐，无法反映样品的真实菌群结构［5-6］。变性梯度凝胶电泳技术(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)是一项研究微生物生态的现代分子生物学技术，1993年由Muyzer等［7］首次应用于微生物生态学研究，不需培养分离微生物，直接提取样品DNA，对目的片段扩增后电泳分析获得菌群结构信息。目前，该技术已广泛应用于土壤、海洋、胃肠道、菌肥、废水、污泥、发酵食品的菌群结构研究。1999年，Ampe等［8］首次采用DGGE技术研究食品菌群结构，随后许多科学家采用该技术对发酵面团、葡萄酒、香肠、韩国泡菜等发酵食品的菌群结构进行了研究。

四川地区的盐渍青菜，俗称酸菜，是泡菜加工企业的主要产品之一，是以当地称为青菜的叶用芥菜(Brassica juncea)盐渍发酵而成的腌渍菜，是制作酸菜鱼底料、老坛酸菜方便面调味料、下饭菜及其他调味料、菜品的重要原料。与家庭传统泡菜不同的是，为了达到长期贮藏蔬菜的目的，腌渍过程中的食盐添加量达10%左右。开展盐渍青菜微生物菌群结构研究，对生产管理、降低食盐用量、降低生产成本等具有指导意义。本文采用DGGE技术对取自生产车间的盐渍青菜的真菌菌群结构进行了解析，对分离培养得到的酵母菌进行了分子生物学鉴定，并对2种方法的实验结果进行了对比分析。

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存

用无菌取样瓶取盐渍青菜(2013年3月19日取自四川省眉山市吉香居、李记食品厂)，样品取回后保存于-20℃冰箱中，及时提取总DNA。1、2号样品为青菜的杆、叶，购自农贸市场;3、4、5号样品为盐渍2个月、14个月、26个月的青菜杆部，6、7、8号样品为盐渍26个月、14个月、2个月的青菜的叶部。

1.2 主要实验药品

Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、UNIQ-10核酸纯化套件、2×Taq PCR MasterMix、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠、尿素、SYBEGREENⅠ(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.3 主要实验仪器

高速冷冻离心机、超净工作台、TECHNE TC-412 PCR仪(TECHNE公司);DYY-5电泳仪(北京六一);凝胶成像仪(Bio-Rad，USA);Bio-rad T1000梯度PCR仪、变性梯度凝胶电泳装置(Bio-Rad，USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 盐渍青菜总DNA的提取

取盐渍青菜样品于冰袋表面解冻，用无菌研钵捣碎得盐渍汁液。取汁液1mL于1.5 mL离心管，10 000 g离心5 min，去上清液，加入500μL裂解液(100 mmol/L Tris-Cl，5 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，1%SDS，pH 7.5)悬浮样品，在 -20 ℃反复冻融3次，加入20μL蛋白酶溶液(20 mg/mL)于56℃水浴60 min。向离心管中加入200 μL无水乙醇，混匀，用UNIQ-10核酸纯化柱套件纯化得总DNA，置于-20℃保存备用。

1.4.2 真菌26S rDNA D2区扩增

PCR 扩增引物［9］:反向引物 NL3A(GAGACCGATAGCGAACAAG)、正向引物NL4A-GC(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGGTCCGTGTTTCAAGACGG)均由上海生工合成，扩增目的片断大小为320bp。PCR扩增体系为50 μL，样品总 DNA4 μL，上游引物 NL4A-GC(10 μmol/L)和下游引物 NL3A(10 μmol/L)各 2 μL，2 × Taq PCR MasterMix 25 μL，无菌超纯水 17 μL。PCR 扩增程序，94℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环;最后72℃延伸7 min。所得产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳。

1.4.3 扩增产物的DGGE分析与测序

制备变性剂(尿素与甲酰胺)线性梯度30% ～60%的8%(W/V)聚丙烯酰胺(37.5∶1，W/W)凝胶，安装好仪器后，移取扩增产物40 μL于点样孔中。在温度为60℃条件下，200 V电泳4 h，取出凝胶，用SYBER GREEN I溶液染色20 min，置于凝胶成像系统中拍照。在紫外防护下，将优势条带切割下来，送上海生工克隆测序，在NCBI网站利用BLAST比对鉴定。

1.5 酵母菌分离与鉴定

1.5.1 酵母菌分离与形态观察

在无菌条件下取盐渍青菜研磨，取5 mL汁液于50 mL的MRS液体培养基中，置于转速为120 r/min、28℃恒温摇床中培养24 h。用无菌生理盐水将富集培养后的培养液稀释，得 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的不同梯度稀释液。分别取 10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释液各 0.2 mL 涂布于 YPD固体平板培养基中，放于30℃生化培养箱中培养24 h，每个梯度做2个平行。将其中具有典型酵母菌菌落特征的菌株挑出，在另一个YPD固体平板培养基上划线培养，镜检，反复2～3次，得到纯化的单菌落。

1.5.2 酵母菌的分子生物学鉴定

1.5.2.1 总DNA的提取

将酵母菌活化培养后，接种于液体培养基中，培养16～24 h，吸取1.5 mL菌液于1.5 mL离心管中，采用Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA，置于-20℃保存。

1.5.2.2 18S rDNA的扩增与测序

酵母菌18S rDNA的扩增反应体系为50 μL，模板 DNA 4 μL，引物 EF3(10 μmol/L)、EF4(10 μmol/L)各2 μL，2 × TaqPCRMasterMix 25 μL，无菌超纯水 17 μL。PCR扩增程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，48℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环;最后72℃延伸10 min，4℃保存10 min。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增成功的样品送上海生工测序，测序结果在NCBI网站进行比对分析。

1.6 系统发育树的构建

将所得的序列与数据库中已知序列进行比较，用Clustal 1.83和MEGA5.0进行相似性分析及做系统发育树，bootstrap为1 000，建树类型为邻接法(neighbor-joining)。

2 结果与分析

2.1 盐渍青菜真菌菌群的DGGE分析

依据实验方法1.4.1提取各盐渍青菜样品总DNA，扩增真菌26S rDNA D2区，采用DGGE分析，结果如图1所示。

由图1可知，盐渍青菜中真菌的基因多样性丰富，各样品之间呈现一定的规律变化，随着盐渍时间的延长，优势条带数量增多。盐渍2个月的青菜杆与叶的真菌生物量相对较少，b、c、d等条带生物量低，而腌渍14个月与26个月的青菜的b、c、d等条带优势明显，依此推断这3个条带对应的微生物在腌渍菜的成熟过程中可能发挥着十分重要的作用。采用QUANTITIY ONE软件的complete linkage聚类方法作系统进化树分析，结果如图2所示，各列之间的相似性矩阵如表1所示。

由图2可知，青菜杆与青菜叶聚于1个小分支，与盐渍2个月的青菜杆与青菜叶聚于一个大分支。盐渍14个月的青菜杆和叶、盐渍26个月的青菜和杆分别聚于一个小分支，4个样品的真菌群落结构聚于一个大分支。由图2与表1可知，各盐渍青菜样品的真菌群落结构的相似度与系统进化树分析结果一致。

由于青菜盐渍过程中添加的食盐比例高达10%左右，乳酸发酵产酸，抑制了真菌的生长，因此，盐渍2个月的青菜杆、叶与原料的相似度较盐渍14个月与26个月的高;经过长期的腌渍后，耐盐耐酸微生物生长繁殖，占据优势，由于高盐、高酸环境的抑制作用，生长缓慢，因此在很长时间内菌群结构保持稳定。

2.2 DGGE条带的序列分析

对DGGE图谱中的优势条带克隆测序、序列比对结果如表2所示。

由表2可知，盐渍青菜5个优势条带中4个为酵母菌，另一条带e与白芥(Sinapis alba)的26S核糖体RNA基因序列相似性最高，推断这个序列是源自于青菜［10-11］。另4个条带分别与假丝酵母属(Candida)、德巴氏酵母属(Debaryomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)的菌株相似。a、d条带分别与NCBI数据库中登录号为GU195657、DQ438242的2株假丝酵母属酵母最为相似，相似度约为99%;b、c条带分别与NCBI数据库中登录号为KC442271、JQ689016的Debaryomyces sp.和鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)相似，相似度接近 100%。Dakal等［14］研究指出鲁氏接合酵母具有耐糖、耐盐特性;Wah等［15］研究表明，强化季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermon-dii)与鲁氏接合酵母共培养物，可提高泰国豆酱风味，杨松彰等［16］报道分离自优质酱油的(Candida versatilis CGMCC3790)、鲁氏接合酵母 CGMCC3791与乳酸菌共同发酵可提升郫县豆瓣酱的品质，Cano-Garcia等［17］报道从自然发酵香肠中分离得的汉逊德巴氏利酵母具有提高产品香味品质的功能。盐渍青菜中的酵母菌具有耐高渗环境的特性，部分酵母具有促进生香功能。

国内外学者针对发酵蔬菜的真菌菌群结构也开展了一些研究。张先琴［12］采用DGGE技术对四川地区家庭制作泡菜微生物多样性研究表明，所得真菌序列与(Meyerozyma guilliermondii)和奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)的序列具有最高相似度。Chang等［13］采用DGGE技术对韩国泡菜的酵母菌分析得到的条带与丝孢酵母属(Trichosporon)、酵母菌属(Saccharomyces)、孢堆黑粉菌属(Sporisorium)、毕赤酵母属(Pichia)的真菌序列具有最高的相似度。比较可知，不同发酵蔬菜之间的真菌优势菌有一定的差异性，这是由于微生物菌群结构受到蔬菜品种、来源、预处理方法及腌渍工艺等因素影响。

2.3 酵母菌分离鉴定

依据实验方法1.5从盐渍青菜中分离得到10株酵母菌，通过分子生物学鉴定，结果如表3所示。

由表3可知，分离获得的酵母菌分别与汉逊德巴利酵母、酿酒酵母、鲁氏接合酵母相似。对比表2与表3可知，分离得到了与DGGE图谱优势条带b、c相似的菌株，未得到条带a、d所对应的酵母菌，这是由于传统培养技术的偶然性、部分微生物对培养条件的选择性所致。张鹏［1］从四川泡菜中分离筛选得到2株酵母菌，通过Sher lock微生物鉴定系统鉴定为粗状假丝酵母(Candida valida)、平滑假丝酵母(Candida parapsilosis);鄯晋晓［2］从泡菜中分离得到6株，通过生理生化试验初步鉴定为酿酒酵母、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、粗壮假丝酵母、异变酒香酵母(Torulopsis glabrata)、异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala);曾骏［3］从传统四川泡菜中分离纯化得到5株酵母，通过分子生物学初步鉴定4株为Kazachstania exigua，1株为膜醭毕赤酵母。不同样品的分离结果有一定的差异，这是由于样品的差异与微生物鉴定方法存在的差异所致。

3 结论

通过PCR-DGGE技术对真菌菌群结构分析表明，盐渍青菜的真菌基因多样性丰富，随着盐渍时间的延长，优势条带数量增多，盐渍2个月的青菜仅有1条优势条带，真菌菌群结构与青菜原料相似，盐渍14个月与26个月的青菜真菌菌群结构相似，并有4条优势条带。通过序列分析表明，4个优势条带分别与假丝酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属的菌株相似。从盐渍青菜样品中分离得到10株酵母菌，通过分子生物学鉴定为汉逊德巴利酵母、酿酒酵母、鲁氏接合酵母。PCR-DGGE技术对盐渍青菜菌群结构的解析不依赖培养，方便简便快捷，获得的实验数据可靠，对生产具有较好的指导作用，是一种有效的研究手段。酵母菌在发酵蔬菜中具有促进香味物质生成、提高发酵蔬菜品质、抑制腐败等功能，可进一步开展发酵蔬菜专用酵母菌筛选、菌剂研发与应用等研究。

致谢:本论文中的样品采集得到了四川省吉香居食品有限公司、李记泡菜四川公司的大力支持，实验开展过程中宜宾学院实验与教学资源管理中心、固态发酵资源利用四川省重点实验室的帮助，在此表示衷心感谢!

［1］ 张鹏.四川泡菜中酵母菌的分离筛选及其应用研究［D］.哈尔滨:东北农业大学，2007.

［2］ 鄯晋晓.四川泡菜菌系分离、筛选及发酵剂的研究［D］. 重庆:西南大学，2008.

［3］ 曾骏，陈安均，蒲彪，等.传统四川泡菜中酵母菌的动态变化规律［J］.食品科学，2014，35(7):81-85.

［4］ 罗松明，刘书亮，杜晓华，等.四川泡菜微生态分布及其与盐度、酸度的关系.［J］食品与发酵工业，2013，39(2):29-34.

［5］ Amann R I，Ludwig W，Schleifer K-H.Phylogenetic identification and in sutu detection of individual microbial cells without cultivation ［J］.Microbiological Reviews，1995，59(1):143-169.

［6］ Ranjardl，Ploy F，Nazaret S.Monitoring complex bacterial communities using culture-independent，molecular techniques:application to soil environment［J］.Research in Microbiology，2000，151(3):167-177.

［7］ Muyzer G，Wall E C，Uiitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA ［J］.Applied Environmental Microbiology，1993，59(3):695-700.

［8］ Ampe F，Omar N B，Moizan C，et al.Polyphasic study of the spatial distribution of microorganisms in mexican pozol，a fermented maize dough，demonstrates the need for cultivation-independent methods to investigate traditional fermentations［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(12):5 464-5 473.

［9］ Vu Nguyen Thanh，Le Thuy Mai，Duong Anh Tuan.Microbial diversity of traditional Vietnamese alcohol fermentation starters(banh men)as determined by PCR-mediated DGGE ［J］.International Journal of Food Microbiology，2008:128(2):268-273.

［10］ Ercolini D.PCR-DGGE fingerprinting:novel strategies for detection of microbes in food［J］.Journal of Microbiological Methods，2004，56(3):297-314

［11］ Omar N B，Ampe F.Microbial community dynamics during production of the Mexican fermented maize dough pozol［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66(9):3 664-3 673.

［12］ 张先琴，张小平，敖晓琳，等.PCR-DGGE分析四川地区家庭制作泡菜中微生物多样性［J］.食品科学，2013，34(12):129-134.

［13］ Chang H W，Kim K H，Nam Y D，et al.Analysis of yeasts and archaeal population dynamics in kimchi using denaturing gradient gel electrophoresis［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，126(1):159-166.

［14］ Dakal T C，Solieri L，Giudici P.Adaptive response and tolerance to sugar and salt stress in the food yeast Zygosaccharomycesrouxii［J］.International Journal of Food Microbiology，2014，185:140-157.

［15］ Wah T T，Walaisri S，Assavanig A，et al.Co-culturing of Pichia guilliermondii enhanced volatile flavor compound formation by Zygosaccharomyces rouxii in the model system of Thai soy sauce fermentation［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，160(3):282-289.

［16］ 杨松彰，崔瑞迎，何菲，等.微生物共培养强化技术对郫县豆瓣酱陈酿过程中挥发性组分变化规律的研究［J］.中国调味品，2013，38(4):18-22.

［17］ Liliana Cano-Garcia，Monica Flores，Carmela Belloch.Molecular characterization and aromatic potential of Debaryomyces hansenii strains isolated from naturally fermented sausages［J］.Food Research International，2013，52(1):42-49.