利多卡因对脓毒症大鼠预后的影响

杨强　常玉林　姚忠岩　刘朝辉

作者单位: 061000河北省沧州市中心医院麻醉科

利多卡因对脓毒症大鼠预后的影响

杨强常玉林姚忠岩刘朝辉

作者单位: 061000河北省沧州市中心医院麻醉科

【摘要】目的探讨利多卡因对脓毒症大鼠预后的影响。方法在96只雄性Wistar大鼠进行盲肠结扎穿孔(CLP)造模。48只大鼠分为对照组(C组)，模型组(CLP组)，早期利多卡因处理组(Lido + CLP组)和晚期利多卡因处理组(CLP + Lido组)，每组12只。每组大鼠分别在CLP后24 h和48 h处死，收集血和肺组织样品用来检测血清中HMGB1水平，肺组织中HMGB1 mRNA表达和重要器官功能指标;同时另取48只大鼠进行生存率分析。结果血清中HMGB1和肺组织中HMGB1 mRNA呈正相关(r =0.94，P＜0.05);血清中HMGB1和肺组织中HMGB1 mRNA在CLP组，Lido + CLP组和CLP + Lido组明显高于C组(P＜0.05);但在Lido + CLP组和CLP + Lido组明显低于CLP组(P＜0.05)。和CLP组相比，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和肌酸磷酸激酶(CK)水平在Lido + CLP组和CLP + Lido组明显降低(P＜0.01)。大鼠生存率在Lido + CLP组和CLP + Lido组明显高于CLP组(P＜0.01)。结论利多卡因可以明显改善生存率，抑制HMGB1表达和保护脓毒症大鼠肝、肾、心等重要器官。

【关键词】利多卡因;高迁移率族蛋白1;脓毒症

脓毒症引起的全身炎性反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)是严重烧伤，感染，创伤或休克患者的主要死因。一项流行病学调查显示，脓毒症发生率正以每年1.5%～8%的速度增加［1］，这对人类健康构成巨大威胁。最近几年许多临床治疗方法包括抗炎策略和液体替换用于治疗脓毒症［2，3］。然而这些方法的有效性并没有很大进展，且脓毒症相关的发病率和病死率仍然增加。因此我们发现新的临床干预方法和药学方法处理脓毒症变得至关重要。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一个非组氨酸核蛋白，原先认为它通过促进转录因子到同源的DNA序列［4］，在调节基因信息上扮演重要角色。HMGB1在脓毒症发生机制上是一个重要晚期炎性介质［5］。HMGB1抗体，特异性拮抗剂或者其他药物制剂等吉抗HMGB1治疗在许多临床前炎症疾病模型上有良好效果，并且减缓这些疾病的严重性和降低其病死率［6］。利多卡因是一种局部麻醉药被广泛用于临床实践。最近研究发现利多卡因可以抑制炎性反应和降低内毒素休克大鼠病死率［7］。然而很少研究做了利多卡因对脓毒症大鼠心肝肾等重要器官功能和HMGB1表达的影响。在本研究中，大鼠脓毒症用盲肠结扎穿孔(CLP)制备，用来观察利多卡因对血清中HMGB1分泌和肺组织中HMGB1 mRNA表达以及血清中谷丙酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肌酸磷酸激酶(CK)水平的影响。本研究的目的是探讨利多卡因对脓毒症病死率，重要器官功能和HMGB1表达的效果。

1　材料与方法

1.1动物与试剂48只健康雄性清洁级Wistar大鼠，体重250～300 g，这些动物由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号: 905713。Trizol(Invitrogen公司，美国);大鼠HMGB1酶联免疫分析试剂盒(上海沪尚生物科技公司);大鼠HMGB1和GAPDH扩增引物(上海英俊公司)。

1.2动物模型建立和管理所有大鼠在手术前12 h空腹，随后腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)并紧接着背侧卧位固定。大鼠脓毒症模型用CLP制备，一条1.5 cm切口沿着盲肠根部和腹中线切开。盲肠壁穿刺3次沿着结扎侧用18 G，随后进行引流以阻止穿刺孔被肠内容物堵塞。肠管放回腹腔随后缝合腹膜腔和皮肤。在对照组仅进行腹部切开，盲肠分离和腹腔关闭。所有大鼠快速给予皮下注射0.9%氯化钠溶液按照术后3 ml/100 g给予。上述麻醉和固定后在CLP之前进行右颈内静脉分离，随后成功置入颈内静脉24G套管针，这个套管针与微量注射泵相连。随机分为4组，对照组(C组)，模型组(CLP组)，早期利多卡因处理组(Lido + CLP组)和晚期利多卡因处理组(CLP + Lido组，每组12只)。在C组0.9%氯化钠溶液(NS)替代利多卡因。Lido + CLP组和CLP + Lido组给予静脉注射利多卡因(4 mg/kg)在CLP前或后1 h。大鼠的临床表现进行观察。每组随机挑选每组6只大鼠分别在CLP后24 h和48 h杀死后收集样品。另外48只大鼠(每组12只)按照在C组，CLP组，Lido + CLP组和CLP + Lido组的方法在CLP后48 h进行处理并计算生存率。

1.3标本处理大鼠在腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，5 ml血样从心脏采集随后在3 000 r/min离心10 min。血清进行收集然后用EDTA处理。100 mg肺组织和收集的血清储存在－80℃用于将来进行研究。

1.4检测血清中HMGB1水平血清中HMGB1水平用ELISA试剂盒进行检测按照试剂盒说明书检测(上海沪尚生物科技公司，上海)。

1.5检测CLP 24 h后血清中生化参数血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK用自动生化分析仪检测。

1.6探测肺组织中HMGB1 mRNA表达100 mg肺组织制成匀浆后，总RNA用Trizol(Invitrogen公司，美国)进行一部提取法抽提，并且随后RNA浓度用紫外分光光度计进行检测。逆转录用2 μg总RNA获得cDNA，作为实时荧光定量PCR的模板。GAPDH作为内部参考基因和HMGB1作为靶基因获得HMGB1和GAPDH在GeneBank的信使RNA序列。特异性引物用Prime5软件设计并且由上海英俊生物科技公司合成(上海，中国)。HMGB1基因序列(158 bp):上游序列是5’-CCATTGGTGATGTTGCAAAG-3’;下游序列是5’-CTTTTTCGCTGCATCAGGTT-3’。GAPDH基因序列:上游序列是5’-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3’;下游序列是5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3’。实时荧光定量PCR在25 μl容积体系进行，体系含有0.5 μl(10 mmol/L)上游和下游引物。12.5 μl 2 倍SYBR Green Mix和双蒸水。扩增条件如下:预变性在95℃2 min; 94℃15 s，58℃15 s，72℃15 s，40循环;收集荧光在72℃。Ct值获得用于统计HMGB1 mRNA的相对表达量和HMGB1与GAPDH基因的比例。

1.7统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析(ANOVA)，Kaplan Meier用作对比组间存活率，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况和病死率在CLP组大鼠出现行动迟缓，食欲减低，嗜睡，竖毛，腹泻，和眼分泌物增多.随着脓毒症的进展发生窒息并且一些大鼠死亡。尸检显示在腹腔中有更多血和化脓性渗出，肠管扩张，和黑色肿大的盲肠。在CLP后48 h，CLP组，Lido + CLP组和CLP + Lido组的死亡数分别是8、3和4只。CLP具有明显的致死效果，利多卡因可以显著改善生存率，在对照组无死亡并且大鼠生存率在CLP组低于LidoCLP组和CLP + Lido组(P＜0.01)。见表1。

表1　4组CLP后48h大鼠存活率比较n =12，只(%)

2.2利多卡因对血清中HMGB1的效果在脓毒症模型建立后24 h和48 h，CLP组、Lido + CLP组和CLP + Lido组血清HMGB1水平高于对照组(P＜0.05)，血清HMGB1水平在CLP组、Lido + CLP组和CLP + Lido组中48 h水平低于脓毒症模型建立后24 h(P＜0.05)。血清HMGB1水平在相同时间点Lido + CLP组和CLP + Lido组比CLP组低(P＜0.01)。在每个相同时间点Lido + CLP组和CLP + Lido组血清HMGB1水平差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2　4组CLP后24 h和48 h大鼠血清中HMGB1水平比较n =6，±s

表2　4组CLP后24 h和48 h大鼠血清中HMGB1水平比较n =6，±s

注:与C组比较，*P＜0.05;与CLP组比较，#P＜0.01

组别24 h　48 h C组4.5±0.4　4.8±0.5 CLP组　14.2±1.3*　13.8±1.2*Lido + CLP组　9.1±1.1* #　8.7±0.9* #CLP + Lido组　11.9±1.1* #　10.8±1.2*#

2.3利多卡因对CLP后24 h血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK的影响与对照组相比，血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在CLP组、Lido + CLP组和CLP + Lido组显著增加(P＜0.05)。与CLP组相比，血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在Lido + CLP组和CLP + Lido组的每个相同时间点水平均降低(P＜0.01)。血清中ALT、AST、BUN、Cr和CK在Lido + CLP组和CLP + Lido组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3　利多卡因对CLP后24 h生化参数的效果n =6±s

表3　利多卡因对CLP后24 h生化参数的效果n =6±s

注:与对照组比较，*P＜0.05;与CLP组比较，#P＜0.01

组别　ALT(U/L)　AST(U/L)　BUN(mmol/L)　Cr(mmol/L)　CK(U/L)C组43±5　150±18　5.8±1.0　23±3　236±25 CLP组　215±31*　590±102*　21.6±3.7*　58±9*　834±153* Lido + CLP组　101±15* #　340±58* #　13.5±2.1* #　46±5* #　552±124* # CLP + Lido组　124±23* #　373±61* #　11.8±2.7* #　48±7* #　511±112*#

2.4利多卡因对肺组织HMGB1 mRNA表达的影响以及血清中HMGB1和肺组织HMGB1 mRNA的相关性血清中HMGB1和肺组织中HMGB1 mRNA呈正相关(r =0.94，P＜0.05)。在CLP模型建立后24 h 和48 h，对照组中肺组织HMGB1 mRNA有弱表达。在CLP组中肺组织HMGB1 mRNA表达在CLP后24 h达到峰值，但在CLP后48 h降低。在相同时间点肺组织中HMGB1 mRNA表达在CLP组高于Lido + CLP组和CLP + Lido组(P＜0.01)。在相同时间点HMGB1 mRNA表达在Lido + CLP组和CLP + Lido组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表4　4组CLP后24 h和48 h肺组织中HMGB1 mRNA表达n =6，±s

表4　4组CLP后24 h和48 h肺组织中HMGB1 mRNA表达n =6，±s

注:与C组比较，*P＜0.05;与CLP组比较，#P＜0.01

组别24 h　48 h C组0.53±0.15　0.46±0.02 CLP组　2.91±0.17*　2.31±0.70*Lido + CLP组　1.75±0.03* #　1.47±0.17* #CLP + Lido组　1.96±0.06* #　1.59±0.11*#

3　讨论

CLP诱发脓毒症休克大鼠模型并且应用到本研究的模型也叫做混合性脓毒症模型。和脂多糖诱发的内毒素休克模型相比，CLP模型可以反映更多临床上脓毒症休克的典型特征。观察我们研究中大鼠的临床表现，应用到本研究的脓毒症模型是成功的。资料显示CLP后早期病死率高达50%［8］。目前利多卡因主要用于局部麻醉，所以CLP后48 h大鼠生存率在本研究中进行观察。我们结果显示利多卡因可以明显改善CLP后大鼠生存率，本研究和Pan等［7］报道的利多卡因显著增加内毒素休克大鼠生存率一致。

HMGB1是一种非组氨酸蛋白并且由Xiang等［9］在1999年首先报道。HMGB1作为一个新的潜在的晚期炎性介质参与脓毒症的发病机制，并被认为是最重要晚期炎性介质，它在脓毒症中具有致死效果［9］。Kuroda等［10］报道了血清中HMGB1表达水平和试验性动物脓毒症进展和严重性密切相关。我们研究显示和对照组相比，HMGB1在相同时间点血清中和肺组织中在CLP组和利多卡因组显著增加(P＜0.05);随后给予利多卡因HMGB1水平在利多卡因组低于CLP 组;并且血清中HMGB1和肺组织中HMGB1 mRNA呈正相关(r =0.94，P＜0.05)。这些结果显示利多卡因可以通过抑制血清和肺组织中HMGB1在脓毒症中扮演重要角色，并且改善脓毒症大鼠的预后。

对于脓毒症患者经常合并多器官功能衰竭的，一个重要的临床选药原则是这个药物是否会对重要器官产生保护效果。在本研究中对重要器官的功能改变进行观察。结果显示和CLP组相比，Lido + CLP组和CLP + Lido组在CLP后24 h血清中ALT，AST，BUN，Cr，CK水平明显降低，显示利多卡因对脓毒症大鼠重要器官具有保护效果。许多研究显示巨噬细胞和其他免疫细胞在各种休克和脓毒症模型中是重要的促炎细胞因子来源。Jiao等［11］报道枯否细胞被认为是脓毒症急性期促炎因子的一个主要来源。在本研究中利多卡因是否通过特异性枯否细胞反应具有肝脏保护效果仍有待进一步研究。

一些重要问题仍有待进一步阐明，例如什么是利多卡因对脓毒症大鼠重要器官保护效果的具体机制，利多卡因参与的保护效果与HMGB1的关系是什么，这是我们研究的局限性。利多卡因抑制HMGB1水平的机制尚不清楚，但可能与下列因素有关:利多卡因可以降低脓毒症动物NO水平，NO可以产生对血管内皮细胞的损害，并且NO和HMGB1密切相关［12］;利多卡因可以降低脓毒症大鼠肝脏细胞NF-κB活性，来抑制像TNF-α等促炎细胞因子水平显示具有抗炎作用;利多卡因可以抑制ONOO-活性，一种强氧化剂，来阻断内皮细胞内ONOO-介导的NF-κB核转移，部分抑制NF-κB活性导致的炎性级联反应信号扩增。NF-κB参与HMGB1/RAGE信号传导，所以抑制NF-κB活性可以导致HMGB1降低。

总之在脓毒症大鼠血清中HMGB1和肺组织中HMGB1 mRNA密切相关。利多卡因可以抑制HMGB1 和HMGB1 mRNA，并且明显改善脓毒症大鼠的生存率。利多卡因在改善脓毒症大鼠预后上扮演重要角色。与此同时利多卡因对脓毒症大鼠的肝，肾和心脏具有保护效果。本研究对脓毒症或脓毒性休克患者提供新的选择。然而需要进一步研究利多卡因在脓毒症中扮演抗炎角色的具体机制。

参考文献

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Effects of lidocaine on prognosis of rats with sepsis

YANG Qiang，CHANG Yulin，YAO Zhongyan，et al.
Department of

Anesthesiology，Cangzhou Central Hospital，Hebei，Cangzhou 061000，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of lidocaine on prognosis of rats with sepsis.Methods The animal models were established by cecal ligation and puncture (CLP)in 96 male Wistar rats in which 48 rats were divided into four groups: control group (group C)，model group (CLP group)，early lidocaine treatment group (Lido + CLP group)and late lidocaine treatment group (CLP + Lido group)，with 12 rats in each group.The rats were sacrificed at 24h and 48h after CLP，respectively，then blood and lung tissue samples were collected for detecting the serum levels of high mobility group box-1 (HMGB1)，the expression levels of HMGB1 mRNA in lung tissue and the functional parameters in important organs.Furthermore the survival rates were observed in the other 48 rats.ResultsThe serum levels of HMGB1 were positively correlated to the expression levels of HMGB1 mRNA in lung tissue (r =0.94，P＜0.05).The serum levels of HMGB1 and expression levels HMGB1 mRNA in lung tissue in CLP group，Lido + CLP group and CLP + Lido group were significantly higher than those in group C (P＜0.05)，however，which in Lido + CLP group and CLP + Lido group were obviously lower than those in CLP group (P＜0.05).As compared with those in CLP group，the levels of alanine aminotransferase (ALT)，aspartate aminotransferase (AST)，blood urea nitrogen (BUN)，creatinine (Cr)，creatine kinase (CK)were significantly decreased in Lido + CLP group and CLP + Lido group (P＜0.01).The survival rates of rats in Lido + CLP group and CLP + Lido group were significantly higher than those in CLP group (P＜0.01).ConclusionLidocaine can significantly improve the survival rate，inhibit HMGB1 expression and protect important organs such as liver，kidney and heart in rats with sepsis.

【Key words】lidocaine; high mobility group box-1; sepsis

(收稿日期:2014－09－22)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.06.010

【文章编号】1002－7386(2015)06－0836－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 446.112