NRG-1对急性心肌梗死大鼠梗死周边区心肌组织电传导速度及CX43表达的影响

李群，张振，王龙

(武汉大学人民医院，武汉430060)



NRG-1对急性心肌梗死大鼠梗死周边区心肌组织电传导速度及CX43表达的影响

李群，张振，王龙

(武汉大学人民医院，武汉430060)

摘要：目的探讨神经调节蛋白1(NRG-1)对急性心肌梗死(AMI)大鼠梗死周边区心肌组织的电传导速度(CV)及连接蛋白43(CX43)表达的影响。方法将24只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和干预组，每组8只。模型组和干预组均结扎冠状动脉前室间支建立AMI模型，假手术组仅带线，不结扎。干预组于造模前30 min经鼠尾静脉注射重组人神经调节蛋白1(rhNRG-1)0.01 μg/g。造模24 h后，通过微电极阵列电极在体记录模型组、干预组梗死周边区心肌组织和假手术组相对应部位心肌组织的场电位，采用Cardio2D软件分析CV，并采用Real-time PCR法检测心肌组织CX43 mRNA相对表达量。结果假手术组、模型组、干预组心肌组织CV分别为(817.17±143.72)、(451.13±167.52)、(871.47±156.14)mm/s，多组间比较，P<0.05；假手术组和干预组均高于模型组，P均<0.05；假手术组与干预组比较，P>0.05。假手术组、模型组、干预组CX43 mRNA相对表达量分别为1.78±0.25、1.42±0.31、3.98±0.45，干预组高于假手术组和模型组，假手术组高于模型组，P均<0.05。结论NRG-1可提高AMI大鼠梗死周边区心肌组织CV及CX43 mRNA表达，有利于稳定心电传导。

关键词：急性心肌梗死；神经调节蛋白1；传导速度；连接蛋白43；大鼠

急性心肌梗死(AMI)时心肌缺血可引起能量代谢障碍、心肌细胞离子电流改变，导致心肌组织自律性、兴奋性、传导性异常，进而诱发心律失常。神经调节蛋白(NRG)是一类含表皮生长因子(EGF)样结构域的营养因子，广泛存在于神经元、胶质细胞以及心、肝、胃、肺、肾、脾等重要器官。NRG-1可以与跨膜酪氨酸激酶的EGF受体家族成员ErbBs形成同源或异源二聚体，通过激活下游的MEK/ERK、PI3K/Akt、JAK/STAT3、Src/FAK等信号通路而发挥

生物学效应[1]。研究表明，NRG-1/ErbBs信号通路可以促进胚胎的心脏发育，在心脏结构与功能的维持中起保护作用，然而关于NRG-1对AMI心肌组织心室电传导速度(CV)及连接蛋白43(CX43)表达影响的研究较少。为此，我们于2014年10月～2015年3月进行了如下研究。

1材料与方法

1.1材料成年雄性SD大鼠24只，体质量250～300 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。重组人神经调节蛋白1(rhNRG-1)购于美国Sigma公司，TRIzol试剂盒购于美国Invitrogen Life Technologies公司，逆转录试剂盒购于美国Thermo公司，PCR反应试剂盒购于美国Roche公司，多道生理记录仪购于美国BIOPAC公司，微电极阵列场电位记录系统(USB-MEA256-System、Cardio2D软件)购于德国Multichannel systems GmbH公司，实时荧光定量PCR仪购于美国ABI公司。

1.2造模与分组处理将24只大鼠随机分为假手术组、模型组和干预组，各8只。模型组和干预组均通过结扎冠状动脉前室间支的方法建立AMI模型：根据大鼠体质量给予1.5%戊巴比妥钠40 mg/kg经腹腔注射麻醉，肌张力消失说明麻醉成功。气管插管后行机械通气，保持大鼠自然呼吸状态，仰卧位固定于手术台，尽量使头部后仰。分别将4个针形电极置于四肢皮下，连接6导联心电图机记录Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVL、aVR、aVF导联的心电图。手术部位行碘伏消毒，铺无菌洞巾。胸壁左旁正中切开皮肤，钝性分离筋膜和肌肉，钳夹断开左侧3、4肋骨，切忌损伤胸膜。用开胸器撑开肋骨，暴露纵隔及心包，保持两侧胸膜完整。用眼科剪纵行剪开心包，充分暴露前室间沟及前室间支，即刻采用5-0缝线结扎前室间支中上1/3交界处(在左心耳至心尖的1/2处)。结扎以下心肌颜色变暗，搏动幅度减弱，肢体导联(Ⅰ、Ⅱ、aVL)心电图ST段抬高>2 mm表明完全结扎且造模成功。不缝合心包，逐层关胸。假手术组仅带线，不结扎。干预组于造模前30 min根据大鼠体质量经鼠尾静脉注射rhNRG-1 0.01 μg/g。

1.3NRG-1对心肌组织CV及CX43 mRNA表达影响的观察

1.3.1心肌组织CV各组造模24 h后再次麻醉，气管插管后行机械通气，开胸暴露心脏，将微电极阵列(MEA)电极片紧贴模型组、干预组梗死周边区以及假手术组相对应部位的心肌表面。MEA电极片面积3 mm×3 mm，共32个记录电极点，每个电极间距为500 μm。采用USB-MEA256-System实时监测MEA电极片于动物在体心脏心外膜采集到的心电信号，即场电位，各组均于场电位监测稳定30 min后采用Cardio2D软件分析获得心肌组织CV。

1.3.2心肌组织CX43 mRNA表达采用Real-time PCR法。模型组、干预组取梗死周边区心肌组织，假手术组取相对应部位的心肌组织，采用TRIzol试剂盒提取各组心肌组织总RNA。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒对RNA进行逆转录，逆转录条件：42 ℃、30 min，80 ℃、5 min。采用FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) PCR反应试剂盒进行聚合酶链反应。CX43引物序列：上游引物：5′-GGTGACAGAAACAATTCCTCGTG-3′，下游引物：5′-CGATTTTGCTCTGCGCTGTAGT-3′，片段长度86 bp。以actin为内参基因，actin引物序列：上游引物：5′-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3′，下游引物：5′-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′，片段长度240 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸15 s，循环40次，溶解曲线从75 ℃至90 ℃，每20秒升高1 ℃。计算CT值，根据ΔΔCT法计算扩增倍数，心肌组织CX43 mRNA相对表达量以2-ΔΔCT表示。

2结果

2.1各组心肌组织CV比较假手术组、模型组、干预组心肌组织CV分别为(817.17±143.72 )、(451.13±167.52)、(871.47±156.14)mm/s，多组间比较，P<0.05；假手术组和干预组均高于模型组，P均<0.05；假手术组和干预组比较，P>0.05。

2.2各组心肌组织CX43 mRNA表达比较假手术组、模型组、干预组CX43 mRNA相对表达量分别为1.78±0.25、1.42±0.31、3.98±0.45，多组间比较，P<0.05；干预组高于假手术组和模型组，假手术组高于模型组，P均<0.05。

3讨论

NRG-1是一类多肽因子，由NRG-1基因编码，通过不同启动子的剪切，能表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等不同的NRG-1亚型[2，3]。研究发现，选择性阻断小鼠ErbB4受体后可出现心肌电传导减慢，收缩功能减弱[4,5]；外源性NRG-1可上调胚胎心脏传导统特异性基因Nkx2.5、GATA4、Irx4 mRNA表达，促进胚胎心脏期传导系细胞分化，甚至可形成异位传导系统[6]；NRG-1对缺血心肌具有保护作用，阻断NRG-1的表达能抑制缺血后心肌收缩功能的恢复[7]。此外，NRG-1预处理能通过激活PI3K/AKT途径减小梗死面积，减少心肌细胞凋亡，保护心肌应对缺血/再灌注损伤[8]。

AMI时心肌细胞膜离子通道受损，引起离子电流异常，导致心脏电活动的形成与传导异常，心肌电传导不稳定，进而促进心律失常的发生。AMI患者梗死周边区心肌组织呈现不同程度的缺血损害，使心肌细胞之间CV明显不同，这种CV的不一致使总体激动传导效率下降，引起传导减慢[9]。鉴于梗死周边区是引发心律失常的重要区域，本研究选择此处心肌组织进行相关指标观察。结果显示，模型组梗死周边区心肌组织CV明显低于假手术组和干预组，而假手术组和干预组心肌组织CV比较无明显差异，说明NRG-1干预可提高AMI大鼠梗死周边区心肌组织CV。与Eto等[10]的研究结果一致。推测可能是NRG-1对心肌细胞的结构功能及排列方式具有保护作用，可增加动作电位除极0相钠离子内流，从而提高激动传导的一致性和CV[11]。

心脏的缝隙连接是形成心肌细胞间电耦联的特殊通道，可使电兴奋快速地在细胞间传导，是形成电冲动快速传导的重要物质基础。心肌细胞的缝隙连接由多种CX构成，主要为CX40、CX45和CX43，CX43在心脏组织和电重构中起重要作用[12]。心室肌的缝隙连接则主要由CX43构成，同时含少量CX45、CX40。研究发现，缝隙连接蛋白的组织结构和CX43表达变化对于心律失常的发生和收缩功能的紊乱具有重要作用[12～14]。正常情况下，CX43在心肌细胞的端端连接处呈簇状分布于闰盘部位，呈磷酸化及非磷酸化两种状态，其中磷酸化的CX43构成有功能的连接通道。当心肌缺血时，CX43表达降低，去磷酸化增加，使有功能的磷酸化CX43储备减少，因此出现传导功能下降。同时缺血引起CX43向四周分散，从缺血区、边缘区到正常区，CX43呈一种破坏性移行性重排，使电冲动的传导不均一性显著增加[15]。有研究表明，在容量超负荷的心衰大鼠模型中，NRG-1与ErbB4结合后激活PI3K/AKT途径，抑制CX43的分解及紊乱新分布，有助于改善心功能[16，17]。本研究干预组CX43 mRNA相对表达量显著高于模型组和假手术组，说明NRG-1能增加AMI大鼠心室肌CX43 mRNA表达，抑制缺血所导致的CX43下降，对心脏电传导起到保护作用，有利于抑制心律失常的发生。

综上所述，NRG-1可提高AMI大鼠梗死周边区心肌组织CV及CX43 mRNA表达，对缺血心肌有保护作用，有利于抑制心律失常、稳定心电传导。

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收稿日期：(2015-05-24)

中图分类号：R473.5

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)48-0029-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.009

通信作者：王龙，E-mail: wanglongwhu@163.com

基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(2014CKB497；2013CKB005)。