鹿等反刍动物瘤胃微生物区系及研究技术进展

■ 刘国兴 张 辉 丛立新

（1.长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室，吉林省吉林市132101；2.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林省吉林市132101）

反刍动物瘤胃因其在高效降解木质纤维素上的特殊地位，而成为动物营养学者的重点关注对象，特别是随着世界能源危机的出现，瘤胃微生物资源的开发和利用已成为目前的一项紧迫的工作。鹿的瘤胃微生物未受现代工业和生活污染，发掘和利用鹿瘤胃微生物资源显得尤为重要。本文对有关鹿等反刍动物瘤胃微生物区系的研究及研究技术进行概述，为研究和开发鹿的瘤胃微生物资源提供依据。

1 传统培养技术研究

20世纪以前瘤胃微生物研究最主要依赖于传统的培养技术。利用该技术发现北海道野生梅花鹿的瘤胃发酵特性显著受季节的影响。瘤胃液pH值冬季高于秋季和夏季，说明夏秋两季瘤胃中VFAs浓度高于冬季。乙酸的浓度冬季时升高，说明鹿的瘤胃微生物主要依靠产乙酸菌发酵以适应冬季的高纤维日粮。夏、秋两季瘤胃内丙酸浓度升高，说明鹿瘤胃微生物利用了可发酵的碳水化合物；同时氨态氮的浓度较高，说明鹿的日粮中可利用的蛋白水平较高，且瘤胃中蛋白质降解菌的数量增多。秋季和冬季梅花鹿瘤胃原虫数量比夏季分别减少28%和10%。冬季梅花鹿瘤胃细菌的数量显著低于秋季，革兰氏阴性球菌的比例显著增大，而革兰氏阴性杆菌的数量显著减少。北海道地区野生梅花鹿瘤胃细菌多样性研究表明，梅花鹿瘤胃中大部分细菌属于CFB的未培养细菌。且在冬季日粮条件较差时，其瘤胃内Streptococcus spp和Ruminococcus spp数量增加[1]。斯瓦尔巴德群岛驯鹿冬季盲肠占整个消化道体积的7%，夏季时为11%，且瘤胃内乙酸与丙酸值冬季显著低于夏季。从夏季到冬季瘤胃内原虫种类无变化，但总数从105减少为104，细菌总数减少10%～50%左右，降解纤维的细菌比例由15%增到35%。淀粉降解菌的数量夏季为冬季时数量的6倍多[2]。李光玉等（1998）研究得出鹿科动物瘤胃微生物区系具有显著的季节效应，原虫数量夏季极显著地高于其他季节（P＜0.01），冬、春两季显著高于秋季（P＜0.05）。

Aagnes等(1995)对冬季挪威驯鹿在不同饲养条件下瘤胃发酵特性进行研究发现，驯鹿放牧饲养时瘤胃液相中主要细菌有Bacteroides spp、Fibrobacter spp和Clostridium spp；饲喂青苔时主要细菌为Streptococcus spp和Clostridium spp，饥饿时优势细菌为Fusobacteri⁃um spp和Eubacterium spp，青苔表面黏附时主要细菌为Bacteroides spp。半家养的成年雌性挪威驯鹿采食牧草的夏季，瘤胃内细菌、产甲烷菌和纤毛虫的数量分别为 5.17×1011、3.17×109和 4.02×107。Methanobrevi⁃bacter spp和未培养古菌为优势产甲烷菌[3]。Sundset等(2007)发现，斯瓦尔巴德群岛秋冬季节采食牧草的驯鹿瘤胃内产甲烷菌的数量秋季时增加，Methanoplasma⁃tales为产甲烷菌的优势菌，与采食精料时瘤胃内的细菌区系不同。放牧时其优势菌群为梭菌目（70.6%）和拟杆菌目（29.4%），而采食精料时优势菌群为Clostridi⁃um spp（91.1%）。Sundset等（2008）在挪威驯鹿瘤胃内发现了耐受地衣酸，而且可在含有地衣酸的培养基中生长的 Eubacterium rangiferina。Hiura等（2010）从北海道地区野生梅花鹿瘤胃内分离到可将水解单宁降解为没食子酸的Streptococcus macedonicus[4]。

传统培养方法缺点是耗时费力，对操作技术要求高，尤其是对严格厌氧的微生物难以操作，其分离培养的种类仅占瘤胃微生物群体的10%～20%。近年来，研究者们经过培养条件优化分离到许多以前未曾培养过的细菌种类。因此，分离培养技术在一定历史时期还将是发现鹿瘤胃新的微生物的一种重要途径[5]。

2 分子生物学技术研究

分子生物学技术的发展推动了反刍动物瘤胃微生物区系的研究。通过提取瘤胃微生物基因组DNA，PCR扩增特定区域、再进行序列测定等途径即可获取瘤胃微生物的群体信息。李志鹏（2014）采用反复冻融-CTAB/SDS/蛋白酶K法与溶菌酶两种方法提取梅花鹿瘤胃微生物基因组DNA，反复冻融法比溶菌酶法更加快捷[6]。非培养技术有以下研究技术方法。

2.1 16S/18S rRNA基因克隆文库技术

小rRNA因具有高度的保守序列而成为理想的靶基因序列，尤其适合于进化不同的微生物的亲缘关系的研究。这种方法是提取瘤胃微生物的基因组DNA并以其为模板，用特定区域序列的引物进行扩增，构建rRNA基因的克隆文库，将其同源性达到97%的计为一个（Optical Transform Unit，OTU），每一个 OTU 即代表一种微生物，根据OTU的数量即可推出瘤胃微生物的数量，从而了解瘤胃微生物体系。

用此方法，Jarvis等（1998）在赤鹿瘤胃内发现了两株细菌LIP4和 LIP5，可将中性油脂、动物油脂和橄榄油水解为长链脂肪酸和甘油，LIP4可将中性、动物性和橄榄油脂水解为以丙酸为主的长链脂肪酸，LIP5的水解产物主要为乙酸、乙醇和琥珀酸，以参照其形态特征将其归属于Clostridium spp XIVa和Propi⁃onibacterium spp。Nelson等（2003）发现瘤牛和斑马瘤胃中至少 24种新细菌种或属。Deng等（2007）发现了大额牛瘤胃液中存在新的细菌种类。刘利等(2009)发现LGCGPB（56.66%）和 CFB（73.33%）是广西水牛瘤胃内的主要细菌；An等（2005）得出牦牛的瘤胃细菌有50%种类尚未被发现。Leng等认为LGCG⁃PB为云南地区大额牛瘤胃优势细菌[7]。Pei等检测到羊驼瘤胃内主要的细菌是Eubacterium spp，山羊瘤胃中的主要细菌是Prevotella spp[8]。刘开朗等(2009)发现反刍动物瘤胃的微生物具有种属特异性，并受地理环境影响。与Yang等得出的牛种瘤胃中细菌组成趋于一致的结论相反，但与Shi等得出的牛瘤胃的微生物体系有种的特异性的结论一致，其原因可能是瘤胃微生物区系受日粮或地理环境影响[9]。公羊瘤胃主要有厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门3种细菌，且受日粮类型影响[10]。与Tajima等（1999）的奶牛瘤胃微生物研究结论相同；肉牛瘤胃微生物区系因日粮的组成及瘤胃的生理部位而异[11]。石鹏君等（2007）通过16S rRNA基因发现波尔山羊、内蒙古绒山羊和南江黄羊瘤胃内细菌具有一定的相似性，其程度种内个体显著高于种间个体，提示瘤胃细菌区系受寄主品种的影响。

李志鹏（2014）得出，鹿瘤胃的细菌主要由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门组成，分别以柞树叶和玉米秸秆为主要粗饲料饲喂时拟杆菌门占99.3%和85%，以后者为主要粗饲料饲喂时瘤胃中厚壁菌门和变形菌门细菌的数量也相对较高[6]。

该方法的缺点是同一细菌基因组内有多个拷贝的16S rRNA基因而影响微生物区系的结果。分析结果容易受微生物基因组DNA大小、PCR扩增引物、条件与效率的影响。

2.2 单链构态多样性分析技术

单链构态多样性分析（Single Strand Conforma⁃tion Polymorphism，SSCP）可将碱基组成不同，数量相同的序列分开。将16S rRNA基因的PCR产物变性形成两股单链，每个单链因其大小与碱基组成的差异，通过氢键形成不同的三维结构，导致在凝胶中产生不同的迁移速率，即产生不同特征的条带图谱。

利用此项技术，Tatsuoka等（2007）对牛瘤胃内产甲烷菌的多样性进行了分析；Michelland等（2003）得出牛瘤胃内古菌群落个体间差异小且具有相对稳定的结构。Boguhn等观测到不同精粗饲料组成的日粮和镰刀霉菌毒素对瘤胃微生物的多样性[12]。

该方法的缺点是双链PCR产物有时会形成3个条带，导致相似的序列之间易形成异源的双链分子而导致分析结果的误差。

2.3 变性梯度凝胶电泳技术

变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）技术已广泛应用于分析微生物的多样性、富集培养物及分离细菌等。DGGE技术是在5’端引物上游加一段富含GC的约40 bp的序列，使双链的DNA变性时氢键不完全断裂。使得碱基组成不同的PCR产物在大小片段相同时进行梯度聚丙烯酰胺凝胶时的解链状态不同，导致停止迁移在不同的梯度凝胶位置，形成不同的条带，在理论上一种微生物形成一个条带，当某种微生物数量多时，则其条带也比较大，出现特异性的条带意味着存在某类特殊的微生物（Muyzer等，1993）。

利用该技术，2001年Kocherginskaya等发现公牛日粮以玉米为主时，优势菌群为CFB，而LGCGPB是以牧草为主时的优势菌。冯薇等（2010）发现乳牛的瘤胃中青贮玉米与羊草表面黏附具有相似性的细菌组成，而苜蓿表面的细菌组成与其相差很大。姚文等（2004）观测到山羊瘤胃中细菌存在多样性的差异。茅慧玲等（2010）证明茶皂素和豆油一定程度地改变了羔羊瘤胃的细菌区系，但不影响细菌的多样性。淡瑞芳等（2009）发现藏系绵羊的瘤胃细菌区系具有季节性的变化规律。崔振亮等发现牛的瘤胃细菌区系受遗传因素品系的影响，日粮中添加青贮桑叶改变了瘤胃细菌的结构，但对其多样性影响不大[13]。Li等（2010）证明了牛瘤胃的上皮不同部位的细菌区系无差异，但与其内容物中的细菌区系不同[14]。Larue等（2005）在山羊的瘤胃液相、植物表面松散黏附和紧密黏附的细菌结构受饲料成分的影响较为显著，使其细菌区系更为复杂。Mackie等（2003）发现反刍动物几乎都存在微生物Oscillospira spp。Zhou等（2010）发现牛瘤胃内的产甲烷菌数量受饲料利用率的影响，当饲料利用率低时甲烷菌组成多，否则较低；牛瘤胃中日粮能量低时会导致富集较多的Methanobrevibacter ruminnatium，而日粮能量高时，Methanobrevibacter smithii增多。

李志鹏（2014）通过比较梅花鹿、荷斯坦牛、波尔山羊的瘤胃细菌结构发现，鹿的瘤胃中细菌数量与荷斯坦牛大致相同，而波尔山羊的瘤胃细菌较少。其中荷斯坦牛以具有降解纤维素作用的Pseudobutyrivibrio ruminis和Eubacterium ruminantium为优势菌。波尔山羊以Clostridium spp为优势菌；鹿的优势细菌是Prevotella spp与Succinivibrio dextrinosolvens，但当梅花鹿采食大量的柞树叶时会导致瘤胃中细菌的多样性降低[6]。

分子指纹图谱技术的DGGE具有快速、重复性高、信息量丰富的优点，可以检测到含量大于1%的微生物。但同一种细菌会因为有多个拷贝的16S rRNA而形成不同DGGE条带，且多样性受16S rRNA基因不同变异区的影响，其分辨率只对不超过500个碱基序列有效。

2.4 T-RFLP技术研究瘤胃微生物多样性

末端限制性片段长度多态性分析（Terminal Re⁃striction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）技术可用于研究环境中微生物的多样性，也可以动态监测微生物的变化。其原理是根据微生物比较基因组学信息，选取一段具有进化特征的目的序列（通常为16S rRNA基因）进行扩增，在上游引物5′端标记荧光物质，限制性内切酶可以消化荧光标记的PCR产物即可被测序仪识别，形成不同的T-RFs限制性片段峰，分别代表不同的OTU，其高度和面积体现微生物的相对丰度。通过网络数据库比对，即可推测其代表的微生物类别。使T-RFLP方法，Avaniss-Aghajani于1996年首次对分支杆菌进行了鉴定；Liu等（1997）研究了白蚁消化道及污泥中微生物群落组成；Fernan⁃do等（2010）分析了肉牛采食粗饲料和精料时瘤胃内细菌区系的变化，共鉴定出115种细菌，但两种日粮条件下厚壁菌门/拟杆菌门差异不显著；Khafipour等（2009）发现奶牛瘤胃中拟杆菌门细菌的数量在瘤胃酸中毒时减少；奶牛泌乳期间，瘤胃、十二指肠、空肠和粪便中的微生物多样性具有显著的差异[15]；山羊瘤胃的细菌数量在日粮中添加葵花油和鱼油后发生了变化[16]；奶牛的瘤胃的原虫数量不受日粮结构的影响，但古菌区系、细菌显著受其影响[17]。李志鹏得出Prevotella spp是梅花鹿瘤胃内的优势细菌，且其微生物区系显著受粗饲料的影响，个体间的差异也较大[6]。

T-RFLP技术是以快速、分辨率高和重复性高而被广泛采用，可直接与网络数据库中的微生物信息进行比对；核酸的测序技术比凝胶电泳技术更准确；快速性且结果以数值形式输出（Marsh，1999），较 DGGE和SSCP来比具有更大的优越性。但是，由于不同类型的微生物可以产生相同的末端片段峰而易导致对样品中微生物的错误估测与认识（李献梅等，2009），也不能在种水平上将微生物彻底区分，其多样性结果会因基因组DNA的浓度、PCR扩增的循环数和限制性内切酶的影响使其应用具有局限性。

2.5 高通量测序技术

高通量测序（High-Throughput Sequencing）又名下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），是相对于传统的桑格测序而言的。可以同时完成传统的基因组学研究以及功能基因组学的基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用的研究。目前高通量测序的主要平台代表有罗氏公司的454测序仪，Illu⁃mina公司的Solexa基因组分析仪和ABI的SOLiD测序仪。在原理上很多的共同之处是①将目标DNA剪切为小片段；②单个小片段DNA分子结合到固相表面；③单分子独立扩增；④每次只复制一个碱基（A，C，T，G）并检测信号；⑤高分辨率的成像系统。

利用这项技术，陈富荣通过构建牦牛瘤胃元基因组BAC文库，从9 600个克隆中筛选获得60个脂肪酶的阳性克隆，123个木聚糖酶的阳性克隆，156个纤维素酶的阳性克隆，得出大量的木质纤维素降解酶基因/基因簇存在于文库中[18]。Pope等得出，斯瓦尔巴德群岛驯鹿瘤胃微生物中以拟杆菌门和厚壁菌门为优势细菌，可降解降解纤维素、木质素和果胶等多种多糖[19]。

3 小结

如前所述，应用传统的培养方法结合分子生物学技术，国内外学者对梅花鹿、驯鹿及梅花鹿等鹿科动物瘤胃微生物区系进行了一定的研究，其技术方法及研究结果不仅有助于丰富瘤胃微生物资源数据库，而且能够为梅花鹿瘤胃发酵的优化调控提供新思路，更能为发掘重要瘤胃微生物基因资源提供基础理论依据。针对反刍动物瘤胃微生物区系研究的每一类方法都有其优点和局限性。传统的分离培养法积累了大量的种群分类数据，可作为生物标记物方法和现代分子生物学技术的标准品或当作分子工具，在功能特性的认识上成为一种独特的优势。传统的分离培养方法可以完成对微生物的定性研究，现代分子生物学可提高解析微生物的灵敏度，在分子水平上开阔了物种的多样性视野，基因指纹技术可对多个样品同时进行分析，直观地显示瘤胃微生物区系的动态变化，也可用其分析调控因子对微生物群落及其功能的影响，进而用其指导瘤胃微生物区系结构。反刍动物瘤胃微生物区系及其多样性解析技术的发展趋势是快速而灵敏、原位、高通量且准确定量。