瘤胃微生物体外降解三叶草与猫尾草的研究

■ 陈光道 李树铭 李秀媛 王文新 朱德全 付钓钧

（1.佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯154007；2.佳木斯市郊区农业技术推广中心，黑龙江佳木斯154004；3.大庆市环境监测中心站，黑龙江大庆163311；4.佳木斯职业学院，黑龙江佳木斯154004；5.佳木斯市第五中学，黑龙江佳木斯154000）

三叶草属于豆科植物，蛋白质含量相对很高，同时由于三叶草质地柔软，新鲜状态细嫩多汁，是草食反刍家畜很好的粗饲料，这种植物也是园林绿化的很好植被植物，三叶草生长势强，侵蚀其它植物性强广泛被人工种植。猫尾草属于禾本科植物蛋白质含量较低，其植物野生性强，对土壤及环境要求不严格，只要不被人为干预均可生长。由于三叶草和猫尾草属于低粗饲料范围内，饲料含粗纤维高，不适合鸡猪等单胃动物消化[1]。本试验旨在通过用牛羊等反刍动物瘤胃中的瘤胃微生物体外消化三叶草和猫尾草后产生的尾产物，作为鸡猪等单胃非草食家畜的饲料，即开辟生物蛋白饲料资源，解决与人争粮食的问题，同时减少由于焚烧这些低粗饲料给环境带来污染等不利因素。确定三叶草和猫尾草不同配比，为人工瘤胃生产生物蛋白饲料提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 瘤胃微生物的提取[2]

牛的瘤胃微生物取自佳木斯市竹板屯屠宰厂刚屠宰后的牛将其瘤胃液装入保温装置带回实验室，用2层纱布过滤后，滤液放入39℃恒温水浴锅保存，备用。

1.1.2 三叶草和猫尾草的制备

将北方10月份三叶草与猫尾草晾干，通过40目粉碎。在70～80℃的烘箱中烘干，备用。

1.1.3 主要试验仪器

电热恒温培养箱（HG303-4，南京实验仪器厂），实验室粉碎机（JFSD-70，上海嘉定粮油仪器有限公司），电子天平（EXP-140型，黑龙江东拓仪器制造有限公司），双目显微镜（BM311110，北京视界通仪器有限公司），恒温水浴锅（HH-24，郑州长城科技工贸有限公司），烘干箱（GW-06A，哈尔滨理化仪器制造厂）。注射器（25 ml）、三角瓶（60 ml）、烧杯、漏斗、胶头滴管、玻璃棒、容量瓶、量筒、滤纸、镊子、纱布、温度计等。

1.1.4 药品与试剂[3]

① 微量元素溶液（A液）：CoCl2·6H2O 1.0 g；Mn⁃Cl2·4H2O 10.0 g；CaCl2·2H2O 13.2 g；FeCl3·6H2O 8.0 g蒸馏水定容至100 ml。

② 缓冲溶液（B液）：NaHCO335.0 g；NH4HCO34.0 g；蒸馏水定容至1 000 ml。

③ 常量元素溶液（C液）：KH2PO46.2 g；Na2HPO45.7 g；MgSO4·7H2O 0.6 g；蒸馏水定容至1 000 ml。

④ 还原剂溶液：Na2S·9H2O 0.625 g；NaOH 0.16 g；蒸馏水定容至95 ml。

⑤瘤胃营养液：蒸馏水400 ml+A液0.1 ml+B液200 ml+C液200 ml+还原剂溶液40 ml。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的含水率测定

待测样品置于烘干箱中100℃条件下放置3.0 h，烘干样品测其含水量，结果见表1。

表1 样品含水率

1.2.2 人工瘤胃培养液的配制

将所需体积的瘤胃液迅速加入到配制好的瘤胃营养液中（瘤胃营养液和瘤胃液的体积比为2∶1），制成混合试验用的培养液。

1.2.3 分装和培养

用电子天平将三叶草粉和猫尾草粉按比例为8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7和2∶8称量样品0.8 g(见表2)，分别放入60 ml三角瓶中。

表2 三叶草粉和猫尾草粉按不同配比称量重量（g）

每个样品设3个重复，同时设2个空白组（只有培养液没有底物）用于产气量的校正。用加样器向每个培养瓶中分别加入上述混合培养液。快速将培养瓶放入预热（39℃）水浴锅中，待加样完毕后成批转入恒温箱中培养，从培养开始到36 h之间每隔2 h快速读取产气量并记录[4]；45 h后转入冰箱内终止试验测定各组干物质降解率。

2 结果与分析

2.1 各时间段总产气量

某一时间点积净产气量计算公式：净产气量(ml)=某时间段3只培养瓶平均产气量(ml)，结果见表3。

表3 不同配比三叶草和猫尾草粉在不同时间的发酵产气量(ml)

2.2 三叶草和猫尾草粉干物质降解率

从表3和图1可以看出，从试验开始到6 h这段时间里几乎没有气体产生，8 h开始增加直到16 h达到高峰，然后产气总量逐渐下降，时间接近36 h时产气量接近零。认为是试验开始至6 h内各组产气量为零，这是由于试验操作及发酵瓶内少量氧气等环境因素对瘤胃微生物胁迫作用不能很好繁殖。随着试验进程氧气逐渐耗尽8 h后瘤胃微生物开始繁殖[5]，瘤胃微生物活性逐渐增强产气量16 h达到高峰，之后随着底物的营养耗尽以及代谢产物的积累，瘤胃微生物受到抑制，36 h瘤胃微生物几乎停止了活动。

图1 试验不同阶段总产气量变化规律

从表3和图2各不同比例草粉累计产气量可以看出：经过统计分析样本三叶草和猫尾草粉7∶3组合气体产量最多，6∶4组合产气量次之，其它6组合产气量少。说明7∶3与6∶4这两组C/N营养成分配比适合瘤胃原虫和细菌的生长繁殖。

图2 不同比例草粉总产气量比较

从表4和图3不同比例草粉干物质降解率可以看出：三叶草和猫尾草粉7∶3组合中干物质消耗最多，6∶4组合次之。其结果与产气量成正比。

表4 不同配比三叶草和猫尾草粉干物质降解率

图3 干物质降解率比较

3 结论

通过三叶草与猫尾草不同配比体外接种瘤胃微生物消化试验可以看出，豆科植物干草三叶草由于含蛋白质较禾本科干草猫尾草高，对瘤胃微生物生长繁殖很有利，在其它条件相对一致时，三叶草与猫尾草大致比例应控制在7∶3左右[6]。三叶草、猫尾草种植对物候和土壤条件要求不苛刻，是很好的人工瘤胃发酵原料。瘤胃微生态很复杂，每种饲料对瘤胃微生物的具体作用都很重要[7]。因此，需要更多的试验来解探索低粗饲料不同配比问题。