植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的最佳条件优化

■李慧芬 马 成 张克顺

(青岛根源生物集团，山东青岛266736)

发酵豆粕生产过程中产生大量对动物有益的菌种、乳酸、多肽等物质，是一种优质的多功能饲料蛋白。用于发酵豆粕的菌种多为乳酸菌，在发酵过程中可产生大量的乳酸。在豆粕的固态发酵中，乳酸菌的主要机制为分泌乳酸和短链脂肪酸，可以促进动物对饲料的消化吸收，抑制病原菌的繁殖，刺激有益菌的生长（Marteaup等，2001）。乳酸是一种重要的抗菌化合物，对致病菌的拮抗起着重要的作用，它使肠道内的pH值和氧化还原电势下降，形成肠道内酸性环境，使肠道中不耐酸的致病菌迅速死亡，从而达到调节肠道菌群平衡的目的（Serviana等，2004）。在体外，乳酸能抑制腐败细菌的生长，从而有效地减少这些微生物产生毒胺、吲哚、氨等致癌物质和其他毒性物质的可能(Stale等，2005)。乳酸是一种高效、无残留、无污染的饲料添加剂，具有促进动物生长、延长饲料保质期、防止饲料霉变的作用，在饲料中的应用越来越广泛。

乳酸的生产主要有生物发酵法和化学合成法，目前化学法已逐渐为微生物发酵法所取代，每年大约有90%的L-乳酸是通过生物发酵法获得的(Wang等，2002)。微生物发酵法生产乳酸，因菌种和培养液不同，乳酸质量和产量有很大差异，乳杆菌以其产酸量高、产酸快、厌氧低能耗、低成本的优势，成为广大研究者关注的热点(Niju等，2004)。近年来，对L-乳酸的生产研究多集中在液体发酵工艺上，考察乳杆菌固态发酵产L-乳酸工艺条件优化的报道比较少，本文主要通过单因素与正交试验结合，优选一株植物乳杆菌固态发酵豆粕产L-乳酸的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料

豆粕：粗蛋白为46%的豆粕，购自龙口香驰粮油有限公司；菌株：植物乳杆菌PHF-3为本实验室选育保存。

1.2 方法

1.2.1 植物乳杆菌接种液制备

用MRS液体培养基培养植物乳杆菌，37℃恒温培养箱内，静置培养18 h。

MRS液体培养基配方：葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三铵0.2%、K2HPO4·7H2O 0.2%、吐温 80 0.1%、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·H2O 0.025%，pH值6.2。

按国标GB 4789.35-2010食品微生物学检验乳酸菌检验测定乳酸菌菌量，并用无菌水调节乳酸菌浓度为2×108CFU/ml。

1.2.2 固体发酵基础条件

豆粕100 g，以2%比例接种植物乳杆菌，加水调节料水比为1∶0.4，初始pH值设定为6，37℃恒温培养箱内，发酵48 h。

1.2.3 L-乳酸测定

10 g发酵豆粕，加入90 ml水，常温磁力搅拌1 h，10 000 r/min，离心10 min，取上清，利用SBA-40D生物传感分析仪，测定L-乳酸含量。

主要测定原理为：生物传感分析仪内含有乳酸氧化酶酶膜，并连接电极。乳酸氧化酶氧化乳酸产生的H2O2的量与被氧化的乳酸量成正比，因此可通过电极测定H2O2的量，来确定乳酸的含量（冯东等，2012）。

1.2.4 单因素试验

以L-乳酸为指标，通过单因素试验确定外加碳源类别、浓度与发酵时间等条件对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响。

在固体发酵基础条件的前提下，外加1.0%的碳源，共比较5种碳源对L-乳酸产量的影响：红糖、糖蜜、葡萄糖、玉米淀粉、玉米粉；在前期试验的基础上，确定外加碳源的类别，进一步考察外加碳源的浓度对L-乳酸产量的影响：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%；在前期试验的基础上，确定外加碳源的类别与浓度，进一步考察发酵时间对L-乳酸产量的影响，取样时间点分别为：0、8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h。每组3个重复。

1.2.5 正交试验

综合3个单因素系列的试验，基本确定影响植物乳杆菌固态发酵豆粕产L-乳酸的各个条件：外加碳源类别、浓度、发酵时间，并以此为固体发酵的基本条件，进一步采用L9(34)正交试验设计(见表1)，优选影响L-乳酸的产生的其他发酵工艺条件，包括乳酸菌接种量、料水比、发酵温度与初始pH值。每组3个重复。

表1 L9(34)正交试验因素水平

1.2.6 数据处理

试验数据采用正交设计助手和SPSS 16.0统计软件进行分析，如果方差分析结果差异显著，则采用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 碳源类别对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响（见图1）

由图1可知，5种碳源添加下，植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸存在一定差异。以玉米粉为碳源时，该菌固态发酵豆粕仅产L-乳酸14.3 mg/g，低于玉米淀粉或葡萄糖，但未达显著性差异（P＞0.05）；以糖蜜或红糖为碳源时，该菌固态发酵豆粕，可产L-乳酸16.8 mg/g或17.0 mg/g，两者间几乎无差异（P＞0.05），但与玉米粉之间的差异达显著水平（P＜0.05）。在实际生产中，外加碳源需考虑性价比，糖蜜的应用成本是红糖的一半左右，且富含生物素、矿物质等，是比较合适的工业乳酸发酵主料。在后续的单因素试验中，其他条件不变，优选糖蜜为外加碳源。

图1 碳源类别对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响

2.1.2 糖蜜浓度对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响（见图2）

图2 糖蜜浓度对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响

由图2可知，在其他发酵条件一致的情况下，随着糖蜜浓度的增加，植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸逐渐增加，并在2.0%时达到平衡。当糖蜜浓度由0.5%增加至1.0%时，L-乳酸产量呈增加趋势，但两者差异未达显著水平（P＞0.05）；当糖蜜浓度继续增加至1.5%时，L-乳酸产量继续增加，与0.5%间差异显著（P＜0.05），与1.0%间差异不显著（P＞0.05）；当糖蜜浓度达2%时，植物乳杆菌PHF-3发酵豆粕产L-乳酸与低糖蜜浓度0.5%、1.0%等达显著差异（P＜0.05），与1.5%及其以上浓度，未达显著差异（P＞0.05）；当糖蜜浓度达到且逐渐大于2.0%时，该乳杆菌固态发酵豆粕产L-乳酸的含量基本达到平衡，且不再随着糖蜜浓度的增加而增加。鉴于此结果，在后续的单因素试验中，其他条件不变，外加碳源确定为2.0%的糖蜜。

2.1.3 发酵时间对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响（见图3）

由图3可知，随着发酵时间的延长，固态发酵豆粕中L-乳酸含量逐渐增加，前32 h时增幅较小（P＜0.05），之后迅速增加，在64 h时达到平衡（P＜0.05），直至96 h发酵结束，L-乳酸含量都没有再显著增加（P＞0.05）。由此可见，在外加碳源与浓度确定情况下，植物乳杆菌固态发酵豆粕能产生的L-乳酸量也是一定的，从产L-乳酸的角度出发，发酵时间超过64 h是没有太大意义的。

综合3个单因素系列的试验，基本确定植物乳杆菌固态发酵豆粕产L-乳酸，选用糖蜜为外加碳源，其浓度确定为2.0%，发酵时间确定为64 h，并以此为固体发酵的基本条件，进一步采用L9(34)正交试验设计(见表1)，优选影响L-乳酸的产生的其他发酵工艺条件，包括乳酸菌接种量、料水比、发酵温度与初始pH值。

图3 发酵时间对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响

2.2 正交试验

2.2.1 正交试验结果的直观与方差分析

按L9(34)正交表，以植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的量为指标，进一步优化该菌的固态发酵工艺。正交试验安排及结果直观分析见表2，方差分析见表3。正交试验可对各因素的影响进行综合评价，由极差比较可知，A、B、C、D 4个因素影响植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的主次顺序为：B＞C＞D＞A，即：料水比＞发酵温度＞初始pH值＞接种量，该结果与方差分析获得的影响因素主次顺序一致，但未达显著性差异水平。此外，根据L9(34)正交试验分析，植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的最佳条件为A1B3C3D1，即接种量2%，料水比1∶0.6，发酵温度42℃，初始pH值6。该优化条件并为出现在正交设计的9个试验中，需进行最优条件的重复验证试验。

表2 产L-乳酸工艺条件的L9(34)正交安排及直观分析结果

表3 产L-乳酸工艺条件的正交试验方差分析

2.2.2 正交最佳条件的验证

设计3个平行重复试验，对单因素与正交试验所得的最佳豆粕发酵条件：以糖蜜为外加碳源，浓度确定为2.0%，发酵时间64 h，乳酸菌接种量2%，料水比1∶0.6，发酵温度42℃，初始pH值6，进行验证。按正交优化条件进行植物乳杆菌的豆粕固态发酵，产L-乳酸含量均值为32.1 mg/g，比单因素试验中最高值20.8 mg/g提高54.33%，同时比正交试验9个系列试验中最高L-乳酸含量(30.0 mg/g)提高7%，说明通过正交试验对豆粕固态发酵条件进行优化，植物乳杆菌PHF-3发酵豆粕产L-乳酸含量有较大幅度提高。

平行重复验证试验结果分别为31.9、32.1和32.3 mg/g，平均值为32.1 mg/g，相对标准偏差(RSD)为0.62%，说明该正交优化条件具有良好的重复性，且在该优化条件下，植物乳杆菌PHF-3发酵豆粕产L-乳酸具有较好的稳定性.

3 讨论

L-乳酸的市场流通价格低廉，以高纯度糖发酵生产L-乳酸显然是不经济的(Solange等，2008)。糖蜜是制糖业的主要副产物，因其富含蔗糖，可以被多种L-乳酸生产菌株直接代谢发酵产生乳酸。Sule等通过考察米根霉以甜菜糖蜜为碳源发酵产乳酸的情况发现，甜菜糖蜜不经处理可直接用于L-乳酸发酵，不需要额外添加其他营养成分(Sule等，2004)。本试验考察外加碳源对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响，最终选定以糖蜜为外加碳源，这是一种储存量大的廉价原材料，在提高L-乳酸产量的同时，也极大地节约了应用成本。

乳酸发酵过程的要点在于营养物质的控制，若营养物添加太少，则菌体生长缓慢，pH值变化不活跃，发酵速度很低，产量低，周期长；相反，若添加过多，则菌体生长旺盛，发酵加快，由于菌体过多消耗营养物而使发酵产率降低（王博彦等，2000）。糖蜜浓度对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响试验结果也显示了类似的趋势，过多的糖蜜添加并未提高L-乳酸的产量，反而造成了浪费，在乳酸菌接种量确定的情况下，2.0%的糖蜜添加，即可满足该菌对碳源的需求。

仇俊鹏等以7 L小罐液体发酵为体系，跟踪了乳酸菌菌量与L-乳酸随发酵时间的变化，16 h时菌体量达到最大，60 h左右L-乳酸含量达到最高，说明在L-乳酸的发酵过程中，生长与产物合成并不同步（仇俊鹏等，2007）。本试验中，跟踪了发酵时间对植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的影响，确定64 h是比较合适的豆粕固态发酵周期，此时L-乳酸含量达到平衡。在本次试验的3个单因素中，发酵时间对L-乳酸产量的影响最大。

胡瑞等研究了固态发酵中各工艺参数对发酵豆粕品质的影响，其中针对粗蛋白含量提升指标上，1∶0.6的料水比是1∶0.4料水比的1.1倍（胡瑞等，2013），或因较多的水分，更有利于豆粕水解，从而提供更多的氮源，进而促进植物乳杆菌的生长与L-乳酸产量的提升。在本次正交试验中，料水比是主要影响植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的因素，最佳水平为1∶0.6，与该试验结果具有一致性。

丁绍峰等以豆粕水解液为氮源，研究了发酵温度、接种量等对L-乳酸发酵产量的影响，结果显示：42℃是比较合适的发酵温度，接种量也并非越高越好。本次正交试验中，对30、37℃与42℃三个发酵温度进行比较，最终确定42℃下豆粕固态发酵产L-乳酸含量最高，与前人的试验结果较为一致。在发酵过程中，过高的接种量会导致前期产酸速度过快，营养消耗过多，后期菌体老化产酸速度放慢，从而影响最终L-乳酸产量(丁绍峰等，2006)。此外，在乳酸发酵中，产物乳酸的反馈抑制，也是限制乳酸发酵过程的主要因素（钱志良等，2003）。植物乳杆菌的发酵液含有一定量的乳酸，对该菌在豆粕中的生长繁殖，有一定程度的抑制作用，本次正交试验结果也显示，2%的乳酸菌接种量，是比较优化的接种剂量，其发酵豆粕产L-乳酸的效果，略强于4%或6%。

徐国谦等研究发现，氨水和NaOH均可以很好地将发酵液的pH值实时控制在6左右，此时菌产乳酸能力最强(徐国谦等，2007)。在固态发酵中，很难做到对发酵体系pH值的实时控制，因此需在发酵前调节初始pH值，本次正交试验结果显示，与7和8相比，6仍是比较合适的固体发酵初始pH值，或因该pH值条件比较适合植物乳杆菌的生长繁殖。

4 小结

本研究通过单因素试验，确定了植物乳杆菌固态发酵豆粕产L-乳酸，可选用糖蜜为外加碳源，其浓度确定为2.0%，发酵时间确定为64 h，并以此为固体发酵的基本条件，进一步采用L9(34)正交试验设计，优选影响L-乳酸含量的其他发酵工艺条件，最终确定影响植物乳杆菌发酵豆粕产L-乳酸的主次顺序为：料水比＞发酵温度＞初始pH值＞接种量，最优发酵工艺条件为：乳酸菌接种量2%，料水比1∶0.6，发酵温度42℃，初始pH值6。对单因素与正交试验所得的最佳豆粕发酵条件进行验证，平均值为32.1 mg/g，比单因素试验中最高值20.8 mg/g提高54.33%，同时比正交试验9个系列试验中最高L-乳酸含量(30.0 mg/g)提高7%，说明通过正交试验对豆粕固态发酵条件进行优化，植物乳杆菌PHF-3发酵豆粕产L-乳酸含量有较大幅度提高。验证重复试验的相对标准偏差(RSD)为0.62%，说明该正交优化条件具有良好的重复性，且在该优化条件下，植物乳杆菌PHF-3发酵豆粕产L-乳酸具有较好的稳定性。本研究确定了豆粕经植物乳杆菌固态发酵后产L-乳酸的最佳条件，显著提高了L-乳酸的产量，为进一步探讨L-乳酸的固态发酵工艺奠定了基础。

（参考文献14篇，刊略，需者可函索）