SBR融合蛋白和减毒沙门氏菌免疫对小鼠涎腺CCL28 mRNA表达的影响及意义

丁广德，姚丽，杨桂梅

(山东中医药大学第二附属医院，济南250001)

SBR融合蛋白和减毒沙门氏菌免疫对小鼠涎腺CCL28 mRNA表达的影响及意义

丁广德，姚丽，杨桂梅

(山东中医药大学第二附属医院，济南250001)

目的 探讨纯化的变形链球菌唾液结合区段(SBR)颌下腺注射和减毒沙门氏菌(SL)灌胃免疫对小鼠涎腺黏膜相关上皮因子CCL28 mRNA表达的影响。方法 将120只BALB/C小鼠随机分为SBR组及SL组各60只。SBR组行SBR融合蛋白颌下腺注射免疫,SL组行SL灌胃免疫。免疫48 h、1周、2周时采用ELISA法检测SBR组唾液中SBR特异性抗体(SBR-IgA)水平； RT-PCR法检测两组颌下腺组织CCL28 mRNA相对表达量。用另选5例BALB/C正常小鼠作为对照组。结果 SBR组免疫48 h及1周、2周时唾液中SBR-IgA水平均明显高于对照组，P均<0.05；SBR组和SL组颌下腺组织CCL28 mRNA相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。结论 SBR融合蛋白经颌下腺接种可诱导小鼠明显的抗体应答；经颌下腺和经胃接种疫苗后涎腺CCL28的表达明显增高。

变形链球菌；减毒沙门氏菌；龋病；黏膜相关上皮趋化因子

唾液中的分泌型IgA(SIgA)在维护口腔健康、抑制致龋菌斑的形成中有重要作用，被认为是抵御龋病病原菌的第一道防线。提高唾液中抗致龋菌变形链球菌的特异性抗体水平是防治龋病的有效途径。黏膜相关上皮趋化因子CCL28是近年来发现的CC家族趋化因子，其受体为CCR10和CCR3[1,2]。研究发现，CCL28 mRNA主要分布于唾液腺、前列腺等组织。有报道称人类CCL28可杀死白色链球菌、绿脓杆菌、化脓性链球菌、克雷伯肺炎杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌[3～5]。涎腺既是黏膜免疫的诱导部位，同时也是效应部位。有研究表明，在涎腺局部行免疫接种，可诱导明显的以唾液特异IgA升高为特征的黏膜免疫应答[6]。2014年1～5月，我们分别观察了纯化的变形链球菌唾液结合区段(SBR)融合蛋白颌下腺注射及减毒沙门氏菌(SL)灌胃对小鼠颌下腺内CCL28 mRNA和特异性抗体表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 实验动物为125只SPF级BALB/C小鼠。取120只随机分为SBR和SL组和各60只，两组均常规饲养于SPF动物房，自由进食水。SBR组行SBR融合蛋白颌下腺注射免疫：于双侧颌下腺区域注射SBR融合蛋白，每只注射40 μg。SL组行SL灌胃免疫：灌胃前4 h撤去饲料和水，灌胃前30 min用5%NaHCO360 μL灌胃中和胃酸；调SL浓度至1010/mL，取200 μL灌胃。另5只为空白对照组(对照组)，自由进食水。

1.2 相关指标观察 免疫48 h及1、2周时，SL组和SBR组分别处死小鼠20只，取唾液0.2 mL和颌下腺组织0.1 g。颌下腺组织制作标本，-70 ℃冻存。

1.2.1 唾液SBR特异性抗体(SBR-IgA)水平 采用ELISA法。取SBR组唾液样品稀释5倍后加到酶标板的各反应孔中，0.1 mL/孔，将微量酶标板用塑料保鲜膜封好，37 ℃孵育2 h；将辣根过氧化酶标记羊抗小鼠SBR-IgA稀释，然后将辣根过氧化酶标记羊抗小鼠SBR-IgA(1∶5 000)加到酶标板各反应孔中，用塑料保鲜膜封好，37 ℃孵育2 h；于各反应孔中加入TMB底物，每孔0.1 mL，用塑料保鲜膜封好，37 ℃蔽光显色5～30 min，当出现明显的颜色变化时于酶标板各反应孔中加入50 μL终止液(2 mol/L H2SO4)终止反应。于酶标仪上测定各反应孔的OD450值，即唾液SBR-IgA水平。

1.2.2 颌下腺组织CCL28 mRNA表达 采用RT-PCR法。取两组冻存的颌下腺组织按每50～100 mg 组织加入1 mL Trizol提取颌下腺组织总RNA；按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 2.1试剂盒说明书，提取总RNA(约8 μg)，RNase Inhibitor 0.5 μL，AMV逆转录酶1 μL等，混匀后置于PCR仪中，55 ℃、30min，99 ℃、5 min，5℃、 5min，终止反应。取同一个反应体系的逆转录反应产物cDNA 2.5 μL，β-actin上、下游引物各5 μL，目的基因上、下游引物各5 μL，Taq聚合酶0.25 μL，退火温度61 ℃、40 min，进行PCR反应；取PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察电泳带，凝胶成像分析系统扫胶拍照，应用软件测定电泳条带的密度值，计算目的基因片段电泳带密度与β-actin基因片段电泳带密度的相对值，即CCL28 mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 唾液SBR-IgA水平 SBR组免疫48 h及1、2周时唾液中SBR IgA水平分别为0.063±0.009、0.053±0.005、0.060±0.017，均高于对照组的0.036±0.009，P均<0.05。免疫各时点唾液SBR-IgA比较无统计学差异。

2.2 颌下腺组织CCL28 mRNA表达 免疫48 h、1周、2周时SBR组颌下腺组织CCL28 mRNA相对表达量分别为0.245±0.006、0.245±0.009、0.241±0.007； SL组分别为0.255±0.009、0.239±0.006、0.248±0.005，对照组为0.121±0.008。SBR组和SL组免疫各时点CCL28 mRNA相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。SBR组及SL组免疫各时点CCL28 mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义。

3 讨论

研究证实，经靶向颌下腺免疫小鼠后，在其颌下腺内由效应细胞产生的细胞因子能够影响抗原特异性反应，因此检测其颌下腺细胞内细胞因子特异性mRNA的表达非常重要。本研究发现，SBR颌下腺免疫小鼠颌下腺组织中CCL28 mRNA相对表达量较高，说明SBR免疫可使CCL28mRNA转录生成增多。鉴于真核细胞基因转录产物为单顺反子(即一个编码基因转录一次只生成一个mRNA分子)，而且在本研究中除了应用SBR蛋白经靶向颌下腺免疫动物外，未加任何其他因素调节mRNA的转录，因此CCL28 mRNA相对表达量可反映SBR蛋白靶向颌下腺免疫CCL28基因的转录活性状态。

研究表明，通过某黏膜途经接种疫苗产生的特异性IgA不但可迁徙至接种的黏膜组织处，还可归巢至其他黏膜免疫部位；抗原在肠道被抗原递呈细胞捕获处理后运送到PEYRE结等黏膜相关淋巴组织，在这里捉捕并处理了抗原的抗原递呈细胞如树突状细胞、B细胞等与抗原特异性Th淋巴细胞相互作用，产生免疫应答。其中致敏的部分B细胞经转型重组后，成为抗原特异性IgA抗体分泌细胞(IgA+ASC)； IgA+ASC经淋巴管进入血循环，迁徙归巢至机体的黏膜免疫效应部位如涎腺、泪腺等外分泌腺和呼吸道黏膜固有层、肠黏膜固有层等，在这些部位最终分化为浆细胞，产生并分泌IgA，发挥效应作用[6]。近期研究表明，趋化性细胞因子CCL28在IgA+ASC经血循环选择性地在某些黏膜免疫效应部位归巢的过程中起关键作用；涎腺上皮细胞表达分泌至涎腺腺泡间组织中的CCL28可通过某种机制转运到局部毛细血管后静脉内皮细胞游离面，通过与IgA+ASC细胞表面的趋化性细胞因子受体CCR10特异结合来启动IgA+ASC出血管机制，引导IgA+ASC迁徙归巢至涎腺[7]。涎腺上皮细胞表达的CCL28也可部分地分泌至腺泡腔，随唾液进入口腔[8]。可见涎腺的双向分泌特征使得其局部产生的CCL28在口腔防御中发挥重要作用。

共同黏膜免疫系统的发现及其作用原理的阐明、新型的黏膜免疫递送系统和黏膜免疫佐剂的发现及成功应用均为防龋DNA疫苗经黏膜免疫接种来诱导特异的体液和黏膜免疫反应奠定了基础[9～11]。通过黏膜途经作免疫接种具有经济、简便的特点，可刺激黏膜免疫系统和全身系统性免疫系统的应答，诱导局部产生长时间的免疫记忆[12,13]。唾液腺作为共同黏膜免疫系统的效应部位能分泌保护性抗体IgA，是通过免疫接种防治龋病及其他感染性口腔疾病的物质基础，通过黏膜免疫途经接种防龋疫苗将有望成为免疫防龋的主要方式。本研究SBR免疫后小鼠颌下腺IgA水平升高，也证明了上述理论。

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1002-266X(2015)06-0031-03

2014-11-12)