高压氧治疗对急性重症胰腺炎大鼠脾细胞凋亡的影响

任一鹏，赵鹏，武祎，张国志，苏春，王长友

(1河北联合大学附属医院，河北唐山063000;2内蒙古医科大学;3遵化市人民医院)

急性重症胰腺炎(SAP)常出现全身炎症反应综合征(SIRS)，并发多器官功能不全(MOF)，致死率高［1］。目前研究认为，免疫功能失调在其中发挥了重要作用［2，3］。脾脏是人体最大的外周免疫器官，势必参与其中。高压氧治疗具有调控免疫功能、清除炎症介质和细胞因子以及调节细胞凋亡与信号转导等作用。我们前期研究发现，SAP大鼠造模后6 h脾脏细胞凋亡最为明显。2013年11月～2014年10月，我们观察了高压氧对SAP大鼠脾细胞凋亡的影响，并探讨其可能的机制，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级SD雄性大鼠75只，体质量200～250 g，由河北联合大学动物实验中心提供。牛磺胆酸钠(Sigma公司)，TUNEL试剂盒(罗氏公司)，Bax、Bcl-2一抗(碧云天公司)，HPR标记山羊抗兔二抗及山羊抗小鼠二抗(碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模 将30只大鼠随机分为观察组和对照组各15只，均经胆胰管注射牛黄胆酸钠构建SAP大鼠模型［4］。观察组于造模完成后60 min内，置于密闭的高压氧舱内2 h(包括升压0.5 h、稳压1 h、减压 0.5 h)，舱内压力为 2.0 ATA，氧浓度为 98%［5］。

1.2.2 腹水测量及血清淀粉酶(AMY)检测 造模后6 h开腹，用注射器吸尽大鼠腹腔腹水，置于量筒中测量。然后，处死大鼠后经门静脉取血，25℃于离心机上以3 000 r/min离心10 min，取上层血清于-80℃冰箱保存，用全自动生化仪检测血清AMY。

1.2.3 胰腺组织观察 留取胰腺组织，行HE染色，电镜下观察胰腺组织变化。

1.2.4 脾细胞凋亡指数(AI)测算 留取部分脾，按照试剂盒说明书进行操作;凋亡细胞胞核为棕褐色，核圆缩，碎裂呈散块状。AI计算方法为高倍镜(40×10)下选定5个视野，每个视野计数100个细胞，计算其中凋亡细胞数所占比例。

1.2.5 脾脏Bax和Bcl-2检测 采用 Western blot法。取部分脾，经液氮研磨后加入冷PBS，匀浆;反复离心至上清，弃去上清液;加入PMSF与裂解液的混合液(1∶100)，冰上裂解30 min;4℃下15 000 r/min离心15 min，取上清液，置于-80℃保存。按测定试剂盒说明测定样品蛋白浓度，计算上样量。行SDS-PAGE电泳，经硝酸纤维素膜转移;10%脱脂奶粉封闭，加一抗，4℃摇床过夜。回收一抗，PBS洗膜3次，10 min/次;加入相应二抗孵 1.5 h，回收二抗;PBS洗膜3次，10 min/次。按照 BeyoECL Plus说明显色，X线胶片曝光。以β-Tublin孵育，作为内参照;以目的蛋白与内参条带光密度比值，作为Bax和Bcl-2表达量。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。所得数据以±s表示，组间比较用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组腹水及血清 AMY比较 观察组腹水(5.80 ±0.76)mL、血清 AMY(1 140.0 ±31.03)U/L，对照组分别为(11.40 ±1.140)mL、(2 673.20 ±104.35)U/L，P 均 ＜0.05。

2.2 两组胰腺组织病理观察结果 对照组叶间隙及腺泡间隔显著扩张，间质血管扩张充血，大量炎症细胞浸润，面积不等的腺细胞坏死;观察组胰腺组织间质水肿、炎症细胞浸润减轻、少量片状出血、坏死。

2.3 两组脾脏 AI比较 观察组 AI为30.07% ±1.14%，对照组为58.07% ±2.37%，P ＜0.05。

2.4 两组脾脏Bax和Bcl-2表达比较 观察组脾脏 Bax表达量 0.991 4 ±0.115 4、Bcl-2 表达量0.771 5 ±0.033 2，对照组分别为 0.679 5 ±0.046 4、0.817 9 ±0.022 9，P 均 ＜0.05。

3 讨论

细胞凋亡在分子水平有着复杂的调控过程，其中Bcl-2家族是重要的调控基因之一，可以分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。我们选取了最具代表性的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2。Bcl-2高表达时，可与Bax形成异源二聚体，拮抗细胞凋亡，使其得到保护;如果在应激等状态下，Bax表达上调，Bax之间形成同源二聚体，促进细胞凋亡［6～8］。

目前，高压氧已广泛应用于治疗一氧化碳中毒、动脉气体栓塞及一些厌氧菌感染和脑血管等缺血缺氧性疾病［9］。现有研究证明［10，11］，高压氧可减少SIRS状态下TNF-α的分泌，并通过缺血缺氧组织的供氧，阻断细胞能量代谢障碍，防止细胞凋亡;同时，也可以通过减少氧自由基的产生，抑制生物膜的脂质过氧化，从而阻断细胞的凋亡过程。

实验证明，脾细胞凋亡在SAP发生后显著增加，其机制尚不完全明确，可能与SAP早期过度炎症反应及炎症介质、细胞因子和氧自由基等大量释放有关［12，13］。但是，脾脏作为最大的外周免疫器官，脾细胞大量凋亡使得免疫细胞耗竭严重，从而使机体对抗原刺激不能产生有效应答，进而无法产生有效保护性免疫反应［14］。本研究显示，与对照组比较，造模后6 h观察组腹水量减少，血清AMY降低，胰腺炎性损伤减轻，脾脏细胞AI降低，脾组织中的Bax表达降低、Bcl-2表达增加。因此我们认为，该作用可能通过调节Bcl-2、Bax表达来抑制脾细胞的凋亡，调控机体免疫功能状态，保持机体免疫平衡，从而明显缓解SAP过程中的免疫抑制。但是，高压氧治疗的临床效果还有待进一步研究，且它仅是一种辅助性的治疗手段，尚不能完全替代常规SAP治疗方法。同时，有文献指出，长期吸入高浓度的氧也会加剧毛细血管内皮损伤，引起血管外渗出［15］。因此，如何制定合理的治疗方案，包括如何选择高压氧治疗的治疗压力、治疗时间、氧气浓度等仍是下一步研究的方向。

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