miRNA-9过表达对Aβ损伤的PC12细胞的保护作用

严钢莉，李朝武，聂海岭，黎逢光，成勇，毛高峰，方煌

miRNA-9过表达对Aβ损伤的PC12细胞的保护作用

严钢莉，李朝武，聂海岭，黎逢光，成勇，毛高峰，方煌

目的：探讨 micro RNA-9（miR-9）过表达对β-淀粉样蛋白（Aβ）损伤的PC12细胞及B淋巴细胞瘤-2 （Bcl-2）、Bcl-2相关x蛋白（Bax）表达的影响。方法：PC12细胞分为miR-9过表达组（E组）、空转染对照组（NC组）、不转染的损伤细胞模型组（NT组），采用CCK-8法检测细胞增殖；采用Annexin-V-PE检测细胞凋亡；采用RT-qPCR检测Bcl-2、Bax mRNA的表达，Western-Blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达。结果：与NC组及NT组比较，E组的PC12细胞转染48 h后增殖增加，凋亡率降低，Bcl-2表达增加，Bax表达下降（<0.05）。结论：miR-9过表达可保护Aβ损伤的PC12细胞。

micro RNA-9；PC12细胞；增殖；凋亡；B淋巴细胞瘤-2；Bcl-2相关x蛋白

阿尔兹海默病（Alzheimer disease，AD）是一种中枢神经系统的变性性疾病，起病隐袭，呈慢性进展性病程，是老年期痴呆中最常见的类型。主要表现为渐进性的认知功能下降、记忆障碍、人格改变、精神行为异常等症状[1]。随着人口老龄化的发展，AD的发病率及死亡率逐年增加，严重影响患者的生活质量，给家庭和社会带来极大的经济负担，目前尚无特效的治疗方法。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白（amyloid β-protein, Aβ）沉积和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT），因此国内外均有将Aβ诱导PC12细胞损伤制备体外AD细胞模型的研究[2]。

近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究显示，Aβ诱导神经细胞的异常凋亡，导致神经细胞和神经突触的丢失是AD发生发展的重要环节[3-5]。Cogswell等[6]研究发现，AD患者micro RNA-9 （miR-9）表达明显下调，Che等[7]进一步验证miR-9的靶基因为β-淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE1），miR-9过表达可下调BACE1的表达，因此笔者推测miR-9在AD的治疗中可提供一个新的分子治疗靶点。

1 材料与方法

1 材料

1.1.1 PC12细胞培养及分组 PC12细胞即大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，由本实验室保存，生长于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基的细胞培养液中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱。每2～3 d换液，传代培养。按实验要求确定种植密度。将细胞分为miR-9过表达组（experimental group，E组）、空转染对照组（negative control group，NC组）与不转染的损伤细胞模型组（nontransfected group，NT组）。

1.1.2 试剂 Aβ25-35（购于美国Sigma公司）用去离子水配置成终浓度1mmol/L，－20℃保存，使用前7 d放于37℃水浴箱孵育“老化”；DMEM高糖培养基（购于中国Thermo公司）；胎牛血清（购于美国Gibco公司）；CCK-8试剂盒（购于上海和元生物技术有限公司）；FITC/PI试剂盒（购于上海贝博生物公司）；Trizol试剂盒（购于上海生工生物工程有限公司）；逆转录试剂盒（购于大连宝生物工程有限公司）；抗BACE1、抗B淋巴细胞瘤-2 （B cell lymphoma-2，Bcl-2）、抗Bcl-2相关x蛋白（Bcl-2 associ-ated x protein，Bax）、抗GAPDH（购于艾博抗上海贸易有限公司）。二抗HRP购自上海艾比玛特生物医药有限公司。Lipo2000试剂盒（购于美国Invitrogen公司）

1.2 方法

1.2.1 生长曲线检测 使用CCK-8法检测细胞活力。细胞以3 000/孔（100μL）种植于96孔板，培养基中分别加入终浓度为 5、10、15、20、25、30μmol/L的 Aβ，37℃、CO2培养箱孵育。24 h后每孔加入CCK-8 10μL，轻轻震荡均匀后，37℃下继续孵育1 h，使用多功能酶标仪测定450 nm的吸光度值。选择细胞活力下降最明显的Aβ浓度作为AD体外细胞模型PC12细胞的预处理浓度。再将Aβ预处理24 h的PC12细胞分组转染后，使用CCK-8法连续测量细胞活力5 d，每组设4个复孔，绘制出细胞生长曲线。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞以105/孔（2mL）种植于六孔板，收集处理后的各组细胞，700 g离心5min，弃去上清液，PBS清洗2次后重悬细胞，将细胞密度调整为2×106/mL；1 000g离心6 min后，弃上清，加入195μL Binding Buffer （1×）重悬细胞，再加入5μLAnnexin V-PE，混合均匀，室温避光孵育10min，1 000g离心6 min，收集细胞，重悬于0.5mLBinding Buffer，立即用流式细胞仪进行检测。

1.2.3 转染 转染前1 d，将细胞以3×105接种于六孔板中。待细胞贴壁，密度达到50%时，E组、NC组按Lipo2000说明书转染步骤分别转染终浓度为50 nmol/L 的miR-9 mimic和 NC mimic，48 h后收集细胞进行 miRNA/mRNA 和蛋白抽提。

1.2.4 总 miRNA/mRNA 抽提 将六孔板内细胞用PBS清洗3次后，每孔加入1mL Trizol，1min后反复吹打裂解细胞。将裂解液转入无RNA酶的EP管，室温放置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈震荡后放置2min，12 000g、5℃离心15min。取上层水相置于新的EP管中，加入双倍体积的预冷的异丙醇，室温放置10min后，12 000g、5℃离心10min。弃上清，将沉淀用1mL预冷的75%乙醇洗涤，自然干燥。最后用去RNA酶水溶解RNA沉淀。

1.2.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）逆转录参照逆转录试剂盒配置25μL反应体系：miRNA/mRNA 模板2μg，RT引物工作液2μL，加去RNA酶水至11μL，70℃放置10 min，冰育2 min；再加入RT buffer（5×）5μL，Mix（2.5 nmol/L）1.25μL，去RNA酶水7.75μL，进行RT反应，42℃，60 min，70℃，10 min。PCR反应体系为20μL：SYBR Prem ix Ex TaqⅡ（2×）10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，模板cDNA 2μL，dH2O 6μL，Rox Reference Dye（50×）0.4μL。miRNA反应条件为：预变性，95℃，20 s，PCR反应，40个循环，95℃，10 s；60℃，30 s；延伸，70℃，10 s。mRNA反应条件为：预变性，95℃，30 s，PCR反应，40个循环，95℃，5 s；60℃，30 s。按照 ABI 7900 Real-time仪器说明书，每一个样本和基因同时做3个复孔，检测得出数据为复孔Ct值的平均值，统计时采用2-△△Ct进行比较。PCR引物由广东锐博生物科技公司设计合成（表1）。

1.2.6 Western blot检测 BACE1、Bcl-2、Bax将各组细胞裂解后提取总蛋白，根据申能博彩的BCA法测定蛋白浓度，将蛋白进行定量后，将上样蛋白配置为每孔70μg。SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜后脱脂牛奶封闭，在室温下封闭1 h，加入一抗抗 BACE1、抗 Bcl-2、抗 Bax和抗GAPDH（1∶500稀释），4℃过夜。第2天加入二抗HRP，室温1 h，洗涤3次后，使用ABIVeriti显影、拍照。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0版统计软件进行分析，单因素方差分析检验，＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Aβ对PC12细胞增殖力的影响

采用CKK-8法检测不同浓度Aβ（5、10、15、20、25、30μmol/L）刺激PC12细胞24 h后的细胞活力，结果显示Aβ浓度与PC12细胞损害程度相关：Aβ为10、15、20μmol/L的 PC12细 胞 与 Aβ为0μmol/L的PC12细胞比较，增殖率分别下降至69.6%、43.5%、73.1%，差异有统计学意义（＜0.05）（图1）。这说明Aβ对PC12细胞的毒性具有浓度依赖性，当Aβ 为15μmol/L时对PC12细胞增殖的影响最大，因此，本研究选用Aβ15μmol/L刺激PC12细胞作为AD的体外细胞模型。

2.2 转染后3组miR-9在PC12细胞中表达比较

2.3 3组BACE1比较

2.4 3组Aβ损伤的PC12细胞增殖比较

与NC组及NT组比较，E组转染miR-9 24 h时细胞增殖无明显变化，48 h后差异有统计学意义（<0.05）（图5），提示miR-9过表达促进Aβ损伤的PC12细胞增殖。

2.5 3组Aβ损伤的PC12细胞的凋亡比较

NC组中正常活细胞占48.6%，凋亡率为47.6%；NT组中正常活性细胞占48.2%，凋亡率为49.3%；E组细胞中miR-9过表达后，正常活性细胞增加至71.9%，凋亡率降至23.7%，与NC组及NT组比较差异有统计学意义（<0.05）（图6）。这表明miR-9过表达可有效抑制Aβ损伤的PC12细胞凋亡。

2.6 3组Bcl-2、Bax表达比较

E组Bcl-2mRNA相对表达量高于NC组和NT组，约为NC组的1.7倍（＜0.05），约为NT组的2.1倍，差异有统计学意义（＜0.05）。NC组与NT组间Bcl-1的mRNA相对表达量差异无统计学意义（＞0.05）。BaxmRNA相对表达量较对照组明显减少，约为NC组的0.43倍（＜0.05），约为NT组的0.45倍，差异有统计学意义（＜0.05），NC组与NT组间差异无统计学意义（＞0.05）（图7）。Western blot检测发现E组Bcl-2蛋白较NC组和NT组明显增加（＜0.05），Bax蛋白表达较NC组和NT组明显降低（＜0.05），NC组与NT组间差异无统计学意义（＞0.05）（图8），与mRNA结果一致。

3 讨论

目前为止，AD的病因仍未完全清楚，但大量基础研究证实Aβ的异常沉积是AD的始动因素之一。Aβ由β分泌酶和分泌酶依次剪切β淀粉样蛋白前体蛋白产生[8-10]。BACE1是天冬氨酰蛋白酶家族成员，为体内的β分泌酶[11]。大多数AD患者BACE1水平升高，导致更多Aβ生成聚集损伤脑组织。BACE1不仅帮助Aβ产生，同时调节诱发记忆力减退的其它细胞过程，影响学习力和记忆力[12-14]。Yang 等[15]研究发现，Aβ对脑组织的损伤导致AD与神经元凋亡机制密切相关。Bcl-2为抗凋亡因子，可通过维持线粒体外膜的构造完整性，阻止Cytc、Smac、AIF向细胞浆释放，从而抑制线粒体凋亡途径的启动[16]，抑制细胞凋亡。Bax为凋亡因子，活化的Bax裂解为多种特定的天冬氨酸蛋白片段，这些蛋白水解片段可促成DNA的裂解和细胞核形态学的改变，从而启动细胞凋亡[17-19]。Bax还可与自身结合形成Bax-Bax同源二聚体，是线粒体膜通道的成分之一，其可改变线粒体膜的通透性，调节细胞色素C、Smac、AIF等的释放，从而诱发Caspase相关的凋亡反应[20]。Bcl-2能与Bax竞争性结合，形成Bcl-2-Bax异源二聚体，抑制Bax活化，关闭线粒体膜离子通道，抑制凋亡[21]。

miRNA是一类小的非编码RNA，约20～26个核苷酸组成，与靶基因mRNA5'-UTR区碱基配对，诱导沉默复合物降解mRNA或阻碍其翻译。多种miRNA在AD中表达异常，如miR-105、miR-125a、miR-138等高表达，而miR-9、miR-10a、miR-10b等低表达，它们共同参与AD的发生、发展[22]。本研究发现，miR-9过表达可有效促进Aβ诱导受损的PC12细胞的增殖，抑制其凋亡，提示miR-9过表达对AD体外细胞模型具有保护作用。为了更好的了解miR-9对Aβ损伤的PC12细胞增殖和凋亡的影响机制，本研究选取miR-9的靶基因BACE1和与凋亡密切相关的Bcl-2和Bax进行检测，结果发现，miR-9过表达后，BACE1 mRNA和蛋白表达均明显减少，提示miR-9可能在翻译及翻译后水平均对BACE1有调控作用。同时，miR-9过表达后Bcl-2明显增加，Bax减少，表明miR-9 对Aβ损害的PC12细胞液神经保护作用的机制与促进抗凋亡因子分泌、抑制凋亡因子表达等有关。

本研究提示，miR-9过表达可抑制BACE1表达，减少Aβ生成，从而降低Aβ的神经毒性作用。同时，miR-9过表达还可促进Aβ诱导损伤的PC12细胞的增殖，其通过Bcl-2、Bax凋亡途径抑制神经细胞凋亡，该结果为miR-9有望成为AD的新的治疗靶点提供了依据。

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（本文编辑：王晶）

Objective:To explore the effect of micro RNA-9 (miR-9)overexpression on proliferation,apoptosis and Bcl-2,Bax expression of PC12 cells treated by Aβ.Methods:PC12 cells were divided into three groups: miR-9 overexpression group (E group),negative control(NC)group and nontransfected (NT)group.CCK-8 method was used to detect cell proliferation.Annexin-V-PE was used to detect cell apoptosis.RT-qPCR and Western blot was to detect the Bcl-2,Bax mRNA and protein expression respectively.Results:Overexpression of miR-9 inhabited the expression of BACEI mRNA and protein,and significantly promoted the proliferation and inhibited the apoptosis of PC12 cells.The expression Bcl-2 was increased and Bax was decreased(<0.05).Conclusion: Overexpression of miR-9 can protect the PC12 cells damaged by Aβ.

micro RNA-9;PC12 cell;proliferation;apoptosis;Bcell lymphoma-2;Bcl-2 associated x protein

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.01.004

解放军161医院神经内科武汉430012

2014-07-06

严钢莉gangli_yan@126.com