实验性自身免疫性肌炎动物模型制备

贾复敏，李悦，卜碧涛

实验性自身免疫性肌炎动物模型制备

贾复敏1，李悦2，卜碧涛2

目的：制备实验性自身免疫性肌炎（EAM）动物模型，观察白介素-6（IL-6）在EAM模型肌肉组织中的表达。方法：豚鼠20只，随机分为模型组12只和对照组8只，模型组采用纯化兔骨骼肌肌球蛋白+弗氏完全佐剂（CFA）免疫注射，对照组给予CFA+PBS免疫注射，2组均每周免疫1次，连续6周，并同时给予2次百日咳菌液腹腔注射。观察2组临床表现、血清肌酶水平及肌肉病理，并采用免疫组织化学方法检测IL-6在肌肉组织中的表达。结果：模型组豚鼠血清中肌酸激酶、乳酸脱氢酶、谷草转氨酶水平均高于对照组，差异有统计学意义（<0.05）。注射免疫第6周末，2组临床评分差异有统计学意义（<0.05），模型组血清肌酶水平与临床评分呈正相关（=0.853，<0.05）。模型组的肌束膜、肌内膜和坏死肌纤维处均有IL-6阳性表达，对照组肌肉标本几乎无IL-6表达。结论：EAM模型制备成功，IL-6在其发病过程中可能起重要作用。

实验性自身免疫性肌炎；动物模型；多发性肌炎；白介素-6

特发性炎性肌病是一种获得性的由自身免疫介导的慢性系统性结缔组织病，其确切的病因及发病机制尚未被完全阐明。近年来的研究表明，免疫机制是特发性炎性肌病发生的主要机制，各种细胞因子在其中起到不可忽视的作用。本实验采用注射免疫的方法制成实验性肌炎（experimental autoimmune myositis，EAM）动物模型，并在此基础上应用免疫组织化学技术检测淋巴细胞和细胞因子白介素-6 （interleukin-6,IL-6）在EAM动物模型肌肉组织中的表达情况，以了解其在炎性肌病发病过程中可能起到的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～12周龄健康雌性豚鼠（普通级动物标准）20只（由湖北省实验动物研究中心提供），体质量260～310 g，根据随机数字表法分为模型组（12只）和对照组（8只）。2组均观察到第6周末后处死。

1.1.2 试剂和仪器 纯化的兔骨骼肌肌球蛋白5mg/0.5mL、弗氏完全佐剂（complete freund's adjuvant，CFA，购于美国Sigma公司），百日咳菌液（购于北京天坛生物制品研究所），抗CD4抗体（1∶100）、抗CD8抗体（1∶100）（购于北京博奥森公司），抗CD68抗体（1∶200）、抗IL-6（1∶300）（购于美国Santa Cruz公司）；两步法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒（购于丹麦DAKO公司）。Roche型全自动生化分析仪（购于瑞士罗氏公司），Eppendorf离心机（购于德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫方法 2组均每周免疫1次，连续6周。免疫方法为背部两侧皮下注射免疫物，注射前均需充分混匀。模型组的免疫物为0.25mL （20μg/mL）/只纯化的兔肌球蛋白+等量CFA。对照组的免疫物为0.25 mL CFA+等量1×PBS。免疫注射头2周，在注射免疫物的基础上，2组均同时给予约2μg百日咳菌液腹腔注射[1]。

1.2.2 检测指标及方法 ①临床症状评估：每周免疫注射前测豚鼠体重，并根据豚鼠活动情况，参照Lennon评分方法[2]对2组豚鼠进行评分。评分标准：0分，肌无力无明显表现；1分，动物无力叫喊或咬啮；2分，静息时体位隆起，头下垂，行走颤抖；3分，肌无力较严重，体重明显减轻，甚至肌肉萎缩，不鸣叫，呼吸费力，近于死亡（表现居中者为 0.5、1.5或2.5分）。②病理检查：2组豚鼠末次免疫1周后，经4%水合氯醛腹腔注射麻醉（4mL/kg）后，每只于活体情况下四肢肌肉多部位取材，所有标本立即用异戊烷-液氮速冻并用25℃恒温切片机连续切片（厚7μm），进行HE染色。观察指标：肌纤维变性、坏死、再生；肌内膜、肌束膜、肌外膜及小血管周围炎细胞浸润；中央核；微血管病变（内膜增厚或闭塞）；脂肪及其他结缔组织增生。③血清肌酶水平的测定：取材后，立即于心脏采血2～3mL，用 Eppendorf离心机离心 10 min （3 000 r/min）分离血清，用Roche型全自动生化分析仪检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、 谷 草 转 氨 酶（aspartate aminotransferase，AST）的数值变化。④SABC免疫组织化学染色：常规冰冻切片，免疫组织化学法测定CD4、CD8、CD68及IL-6在豚鼠肌肉组织中的表达。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 临床表现

注射免疫2周后，所有动物局部均产生硬结。对照组8只动物注射免疫后局部有直径0.3～0.5 cm硬结，约3～4周后，其中5只豚鼠硬结破溃，后又自愈，其余3只豚鼠硬结无破溃，逐渐变小、消失。对照组豚鼠各项活动无明显异常，体重逐渐增加。模型组12只豚鼠皮下注射2周后，局部均有直径约0.5～1 cm的硬结。除少数豚鼠硬结未破溃，整个免疫过程中临床症状不明显，有的接近于对照组外，其余豚鼠第3周后背部皮肤脱毛、硬结变软、红肿，有波动感、局部温度升高。第4周时最明显，硬结破溃，有大量黄白色、较稠、微臭的液体溢出；且其中有5只豚鼠有胸腺、颈部淋巴结肿大，2只有腹股沟淋巴结肿大。第5周破溃处开始慢慢结痂、愈合。1只豚鼠于免疫第5周时死亡，主要表现为进食和呼吸费力，死后尸体解剖其他脏器未发现明显的病理改变，肌肉活检发现肌细胞变性、坏死及炎性细胞浸润，死亡原因主要考虑由肌炎引起的吞咽和呼吸功能衰竭所致。剩余有症状的豚鼠（7只）在第4周左右表现最明显，主要为对称性四肢无力，以双下肢最为严重，行走颤抖，体重下降，毛色无光泽及脱落。

2.2 血清肌酶水平测定结果

模型组豚鼠血清中CK、LDH、AST的平均水平均高于对照组，差异有统计学意义（<0.05），见表1 。

表1 2组豚鼠肌酶测定结果（IU/L，±s）

注：与对照组比较，①<0.05

组别 只数 CK LDH AST对照组 8 792.0±142.6 111.8±37.4 103.8±25.1模型组 12 2099.6±884.1① 254.7±78.8① 204.5±75.0①

2.3 临床评分

模型组的临床评分于第3周开始升高，于第6周末为（1.62±1.05）分，对照组为0分，2组差异有统计学意义（<0.05）。

2.4 血清肌酶水平与临床评分之间的相关性

注射免疫第6周末，模型组血清肌酶水平与临床评分呈正相关（=0.853，< 0.05），见图1。

2.5 肌肉病理及组化染色

模型组的主要改变包括肌纤维变性、坏死、偶有再生；肌纤维间的小血管周围有炎性细胞围绕，管壁增厚，甚至闭塞；肌外膜、肌束膜、肌内膜也有炎性细胞浸润。对照组肌肉组织未见肌纤维变性坏死和炎性细胞浸润。模型组肌肉标本免疫组化染色显示肌束膜和间质内有许多CD4+T淋巴细胞浸润，偶见于肌内膜；CD8+T淋巴细胞浸润肌内膜，其数目少于CD4+T淋巴细胞；CD68+巨噬细胞也主要浸润肌内膜，可见吞噬现象，在坏死肌纤维处明显阳性表达；肌束膜、肌内膜和坏死肌纤维处均有IL-6阳性表达。对照组肌肉标本几乎无IL-6表达，见图2。

3 讨论

骨骼肌肌球蛋白是自身免疫性疾病研究的动物模型常见诱导物[3,4]。本实验采用纯化的兔骨骼肌肌球蛋白作为抗原，并同时加入CFA及百日咳菌液（前2次）连续6次免疫豚鼠，成功地诱导出EAM模型，阳性率约达66.7%，对照组无1例发病，这说明骨骼肌肌球蛋白是EAM的自身抗原，与国外研究一致[5]。

EAM与人类多发性肌炎（polymyositis，PM）在病理上有相似之处，如模型组肌肉HE染色显示肌纤维变性、坏死，偶见再生，一些炎性细胞浸润肌纤维内膜，免疫组化染色显示肌内膜浸润的炎性细胞主要是CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞。其CD8+T细胞主要侵袭非坏死肌纤维，CD68+巨噬细胞大部分在坏死肌纤维附近。此外，也可见小血管周围有大量炎性细胞围绕，血管壁增厚，甚至闭塞，最终可能会导致血管数量减少，肌纤维进而继发缺血坏死。近来研究表明微循环受损也参与PM的发病，尤其在PM发病的早期阶段[6]。但EAM模型的病理特征也有别于人类PM，浸润的炎性细胞不仅有CD8+T细胞，在肌内膜（少数）、肌束膜、肌外膜区域也可见到大量CD4+T淋巴细胞，且 CD4+T细胞的数目远远多于CD8+T细胞，这种现象可能与炎症处于免疫反应早期阶段有关[7]。此外在临床表现、CK水平上也有相似之处，模型组大部分（约58%）豚鼠在免疫注射第4周左右开始出现活动明显减少，体重缓慢下降，对称性四肢无力，双下肢最为严重，行走颤抖，甚至爬行。于免疫注射第6周末，血清CK水平高于对照组，差异有统计学意义（<0.05）。但对照组中个别豚鼠血清CK水平（轻度升高）与模型组接近，这可能由 难以控制的溶血造成的[8]。此实验中模型组豚鼠临床评分与CK水平经相关性分析，两者呈正相关。但也发现约25%的豚鼠的临床评分与血清CK水平不平行，该情况在临床中也较常见，具体原因尚不清楚。另外约16.7%豚鼠肌无力等临床表现严重，血清CK水平升高，但肌肉病理并无明显改变，这一现象可能与疾病正处于急性期，肌肉炎性反应并未到达高峰，肌细胞损伤较轻，致使肌肉病理改变不明显，血清CK水平升高可能由EAM累及心肌造成的。上述本实验无法完全解释的现象，将成为下一步探讨的方向。

IL-6是一种多功能的细胞因子，它能调节免疫应答、炎症反应[9]，其在炎症和免疫反应中的信号调节失常可能导致一些疾病的开始及维持，如风湿性关节炎等。且它已被证实在许多实验性自身免疫性疾病中扮演重要角色，如实验性自身免疫性脑脊髓膜炎等[10]。本实验观察到IL-6在模型组肌肉组织中表达显著增多，主要表达在肌内膜和坏死的肌纤维处，尤其是坏死肌纤维，且坏死严重区域比较轻区域表达明显，这意味着IL-6可能与肌纤维坏死有关，参与EAM的发病。IL-6主要由单核巨噬细胞等产生。本实验免疫组化染色显示CD68+巨噬细胞的阳性分布与IL-6阳性结果分布比较相似，笔者推测CD68+的巨噬细胞可能是IL-6细胞因子的主要来源，这曾在国外C-蛋白诱导型肌炎（C protein-induced myositis，CIM）模型中有报道[11]。但近来有研究发现受损肌细胞本身也可能分泌IL-6[12]，其主要来源有待进一步证实。IL-6可能参与EAM发病的具体机制尚不清楚，在炎性环境下，IL-6可与其受体结合刺激血管内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1，使淋巴细胞迁移至炎症区域；IL-6也可诱导肌纤维产生细胞间黏附分子-1，细胞间黏附分子-1 与CD8+T淋巴细胞膜上淋巴细胞功能相关分子-1相结合增强CD8+T细胞介导的细胞毒性[13]。除此之外，它也可能促进Th17细胞分化[13]，而Th17细胞目前已被证实参与一些EAM疾病动物模型的形成，并在其中起关键作用[14]；这提示IL-6也可能参与人类PM的发病，并可能在其中起重要作用。

志谢 感谢中国人民解放军北京总医院神经科蒲传强教授给予的大力支持！

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（本文编辑：王晶）

Objective:To establish an animal model of experimental autoimmune myositis(EAM),and to observe the expression of IL-6 in the muscle of animals.Methods:Twenty guinea-pigs were randomly assigned into EAM group (n=12)and control group (n=8).The EAM group was subcutaneous injected with rabbit skeletal muscle myosin plus Freund's complete adjuvant(CFA),and the control group was received CFA and equal amount of PBS.Each guinea-pigs received twice injection of pertussis toxin.The animals in both groups were immunized once a week,lasting for 6 weeks.The clinical manifestation,the serum muscular enzymes levels and pathology of the skeletal muscles were observed.The immunohistochemistry technique was used to detect the expression of IL-6 in the muscle tissue.Results:The serumLevels of creatine kinase,lactate dehydrogenase and aspartate aminotransferase of the EAM group were increased significantly,compared with those of the control group (<0.05).At the 6th week,there was statistical difference of the 2 groups in the clinical scores,and the serum muscular enzyme levels were positively correlated with the clinical scores in the EAM model group(=0.853,<0.05).In the perimysium,endomysium,necrotic fibers of the EAM group,the level of IL-6 was dramatically up-regulated compared with control group with rare expression.Conclusion:The establishment of EAM animal model is successful.IL-6 may play an important role in the pathogenesis of EAM.

experimental autoimmune myositis;animal model;polymyositis;interleukin-6

R741;R746.9

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.01.003

1.湖北省新华医院神经内科武汉430015

2.华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉430030

2014-09-01

卜碧涛bubitao@tjh.tjmu.edu.cn