重复经颅磁刺激对脑缺血大鼠海马突触素表达及学习记忆的影响

周宁，吴洪阳，黄本荣，杨娜娜，韩肖华

重复经颅磁刺激对脑缺血大鼠海马突触素表达及学习记忆的影响

周宁1a，吴洪阳2，黄本荣1b，杨娜娜1a，韩肖华1a

目的：观察10Hz重复经颅磁刺激（rTMS）对脑缺血大鼠海马突触素（SYN）的表达及学习记忆的影响。方法：将36只雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组和rTMS组，每组12只。制备双侧颈总动脉永久结扎脑缺血模型，假手术组不造成缺血，rTMS组给予10Hz rTMS，共28次。采用Morris水迷宫评价学习记忆能力；利用电生理实验检测海马CA1区的长时程增强（LTP）；Western blot检测海马SYN蛋白的含量。结果：与假手术组比较，模型组的逃避潜伏期明显延长，60 s内跨越平台次数减少；与模型组比较，rTMS组大鼠的逃避潜伏期缩短，60 s内跨越平台次数增加，fEPSP波幅提高，海马SYN蛋白的表达增高，差异有统计学意义（<0.05）。结论：rTMS能促进脑缺血大鼠海马SYN蛋白的表达和增强高频刺激引起的LTP，这可能是rTMS改善脑缺血损伤引起的学习记忆障碍的作用机制之一。

经颅磁刺激；脑缺血；突触素；长时程增强；学习记忆

自1985年Barker等首次将磁刺激技术应用到中枢神经系统以来，经颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation，TMS)以其无创、无痛、操作简便、可深部刺激及副作用小等优势被广泛应用于基础和临床。1989年出现的重复经颅磁刺激 (repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)，可以利用一定强度的时变磁场来刺激兴奋组织,在皮质产生可传导性的感生电流，从而对刺激位点或皮质兴奋性产生抑制或易化，影响大脑的电活动和调节大脑皮质的兴奋性。近年来，因在刺激结束后仍有持续的生物学效应，rTMS逐渐被作为一种治疗手段应用于抑郁症[1]、帕金森病[2]、卒中[3]等疾病。

新近的一项荟萃分析发现，rTMS可促进卒中患者手运动功能的恢复和大脑皮质的可塑性[3]，有动物实验也证实rTMS可改善急性脑梗死大鼠的运动感觉功能[4]，但rTMS对脑缺血后学习记忆功能的影响及其可能的机制尚不十分清楚。突触传递的长时程增强（long-term potentiation，LTP）是指高频刺激（high-frequency stimulation，HFS）传入神经纤维后引起突触效能的持续性增强,是研究学习记忆的重要电生理指标之一。突触素（synaptophysin，SYN）是突触囊泡的一种特异标志性膜蛋白，与神经可塑性密切相关。本研究拟观察rTMS对脑缺血大鼠海马SYN蛋白和LTP的影响，以期从结构和功能角度阐释rTMS改善脑缺血大鼠学习记忆功能的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 SPF级雄性SD大鼠36只，体质量（250±20）g，由同济医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分为3组：假手术组、模型组和rTMS组，每组12只。

1.1.2 实验试剂 抗大鼠SYN抗体（购于美国Chem icon公司），β-Tubulin（购于美国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备 参照Annaházi等[5]的方法复制大鼠双侧颈总动脉永久性结扎（2-vesselocclusion，2VO）脑缺血模型。腹腔注射6%的水合氯醛（350mg/kg），颈部正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，避免损伤迷走神经和交感神经干，以“4”号丝线双重结扎；假手术组只分离双侧颈总神经，不结扎。

1.2.2 干预方法 采用武汉依瑞德公司生产的磁刺激仪（CCY-I型），动物环形线圈（线圈外径6 cm，中心最大磁场强度3.5 T）中心处于大鼠前囟右旁开0.5 cm处（M 1区），刺激强度为120%静息运动阈值（26%最大磁场强度），刺激频率为10 Hz，总刺激量为300脉冲，单序列30脉冲，中间间隔50 s。rTMS组大鼠于造模成功次日即开始治疗，每日1次，共28次。模型组和假手术组自然饲养，不作特殊处理。

1.2.3 Morris水迷宫测试 定位航行实验：从实验的第24天开始每天训练4次，共训练5 d，记录其寻找到平台的时间（逃避潜伏期），反映动物的学习能力。如果大鼠在60 s内未找到平台，潜伏期记为60 s，并由实验者将其牵引至平台上，停留30 s，再放回笼中。空间探索实验：实验第29天进行空间探索实验，撤除平台，任意选一个入水点将大鼠放入水中，记录其在60 s内跨越平台次数，反映大鼠的空间记忆能力。

1.2.4 Western blot检测SYN蛋白 治疗结束时，每组随机选择6只大鼠，腹腔注射6%的水合氯醛深度麻醉，迅速断头取脑，剥离大脑皮质，称取右侧海马组织50mg，裂解、匀浆，取上清液，蛋白定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、电转移和膜封闭，封闭结束后分别用抗大鼠SYN抗体室温孵育。二抗孵育后显色、曝光、显影，以Gel pro4.0版凝胶光密度分析软件分析SYN蛋白条带灰度值，计算各条带灰度值与内参β-Tubulin蛋白条带灰度值的比值，进行半定量分析。

1.2.5 LTP测定 治疗结束时，各组选取余下大鼠，乌拉坦麻醉（1.4 g/kg i.p）后固定于脑立体定位仪上。记录电极定位坐标：前囟后（AP）为3.0～3.3mm，中缝线右旁开（R）为2.0～2.5mm，硬脑膜下的深度（H）为1.8～2.2mm；刺激Schaffer侧枝电极坐标：AP为3.6～3.8 mm，R为3.2～3.5mm，H为2.0～2.5mm。用推进器在坐标处将刺激和记录电极尖端插入到相应的深度，用单脉冲刺激即可记到兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potentials，fEPSPs）。HFS参数设定：电压强度为最大响应值75%～85%所对应的电压幅度值，刺激模式-串单刺激，波宽0.2ms，延时40 ms，波间隔9.8ms，重复次数4次，脉冲组数100，主周期300 s。用多道生理信号采集处理系统记录和分析CA1区细胞外场电位。测出fEPSP幅度(mV)，以HFS 30m in前的fEPSP的幅度均值作为基础水平，再分别计算出HFS后60 min内各观测时刻fEPSP平均幅度(mV)与HFS前基础水平幅度(mV)平均值的百分比。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Morris水迷宫测试结果

模型组大鼠在定位航行实验中的逃避潜伏期与假手术组比较明显延长< 0.05）；在空间探索实验中，60 s内跨越平台次数与假手术组比较减少（<0.05），提示模型组大鼠存在学习记忆功能障碍。与模型组比较，rTMS组大鼠的逃避潜伏期缩短，60 s内跨越平台次数增加，差异有统计学意义（<0.05），提示经过rTMS治疗后，脑缺血大鼠的学习记忆功能改善（表1）。

表1 各组大鼠Morris水迷宫测试结果比较（±s）

注：与假手术组比较，①<0.05；与模型组比较，②<0.05

分组 只数 逃避潜伏期/s 60s内跨越平台次数/次假手术组 12 13.38±5.84 4.03±0.76模型组 12 37.15±7.43① 1.83±0.51①rTMS组 12 24.38±6.77①② 3.48±0.89②

2.2 LTP测定结果

HFS后于各组大鼠患侧海马CA1区记录到的fEPSP的波幅均较HFS前有所增加，尤其以假手术组明显，达到刺激前基础水平幅度的（148.35±24.42）%；模型组增至基础水平的（116.78±21.94）%；rTMS组的fEPSP波幅显著提高，达到刺激前基础水平幅度的（132.33±19.58）%，与模型组比较差异有统计学意义（< 0.05）（图1、表2）。

2.3 SYN蛋白印迹分析结果

表2 各组大鼠SYN蛋白表达及fEPSP幅度比较（±s）

注：与假手术组比较，①<0.05；与模型组比较，②<0.05

分组 n SYN蛋白 fEPSP幅度/%假手术组 6 0.23±0.07 148.35±24.42模型组 6 0.47±0.10① 116.78±21.94①rTMS组 6 0.63±0.16①② 132.33±19.58②

3 讨论

研究发现，中国缺血性脑卒中发病率占总卒中的45.5%～75.9%[6]。缺血性脑卒中影响患者的认知功能，可严重影响患者的康复治疗效果及其日常生活质量，最终可能发展为血管性认知障碍。因此对于脑缺血患者，除了关注其运动功能的恢复外，如何提高其学习记忆功能也至关重要。海马与认知功能密切相关，海马损伤可导致学习与记忆功能障碍[7]。中枢神经系统是缺血缺氧损伤最敏感的效应靶器官之一，海马神经元对缺血缺氧非常敏感。缺血性脑卒中患者常出现注意力不集中、学习记忆能力下降等表现，实验动物也表现Morris水迷宫实验成绩下降[8,9]。因此，本研究观察rTMS对脑缺血大鼠海马突触素及学习记忆的影响。

本研究发现，模型组大鼠海马SYN蛋白的表达较假手术组增高，反映机体在缺血缺氧时，SYN表达和生成增加[10]，这可能与脑缺血导致损伤区微环境变化，刺激神经再生有关。但中枢神经系统再生能力较低下。SYN是突触囊泡的一种特异标志性膜蛋白，其数量和分布密度可间接反映突触的密度[11]，突触功能重建时SYN表达明显增多，与神经可塑性密切相关。本研究发现，rTMS能促进脑缺血大鼠海马SYN蛋白的表达，这为rTMS治疗促进缺血性卒中患者海马突触功能重建提供了佐证。

本研究在Morris水迷宫实验中观察到rTMS能明显缩短缺血大鼠逃避潜伏期，增加其60 s内跨越平台次数，提示rTMS能改善脑缺血大鼠的学习记忆障碍，与赵文娟等[12]和赵秀秀等[13]的研究结论相近。海马是学习记忆过程中起关键作用的中枢结构，LTP是海马突触可塑性的重要形式，是学习记忆的神经细胞学基础[14]。本研究同时在电生理实验中发现rTMS对脑缺血大鼠海马HFS诱导的LTP有增强作用，这与行为学实验结果一致，即从整体和细胞水平证实rTMS对脑缺血损伤引起的学习记忆障碍有改善作用。

由于在皮质产生可传导性的感生电流，从而影响大脑的电活动和调节大脑皮质的兴奋性，因此rTMS越来越广泛地运用于神经科学和康复医学领域[15]。本研究证实，rTMS能促进脑缺血大鼠海马SYN蛋白的表达和增强对海马HFS诱导的LTP，这可能是rTMS改善脑缺血损伤引起的学习记忆障碍的作用机制之一，为rTMS运用于缺血性卒中导致的学习记忆障碍的临床治疗提供了实验依据。

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（本文编辑：王晶）

Objective:To investigate the effect of rTMS on the expression of synaptophysin in hippocampus and learning and memory in rats after cerebral ischemia.Methods:Thirty six male Sprague-Dawley rats were randomly assigned to sham operation group,model group and rTMS group.A rat model of permanent bilateral occlusion of the common carotid arteries(2-vessel occlusion,2VO)was established.rTMS treatments(10 Hz)were performed once per day since 1 d after 2VO,lasting for 28 d.The function of learning and memory of rats was assessed by Morris water maze test.The changes of long-term potentiation in CA1 area were investigated with electrophysiology study and the expression of synaptophysin in hippocampus was investigated with Western blot technique.Results:Compared with the sham operation group,the rats of model group demonstrated significantly increased latency to locate the submerged platform and decreased frequency of swimming across the platform in 60 s.In the rTMs group,the latency to find the submerged platform decreased,the frequency of swimming across the platform in 60 s increased,the amplitude of field excitatory postsynaptic potentials increased and the expression of synaptophysin in hippocampus increased significantly,compared with those of model group（<0.05）.Conclusion:rTMS could promote the expression of synaptophysin in hippocampus and increase the LTP induced by high frequency stimulation,which may be one of the possible mechanisms of amelioration learning and memory impairment after cerebral ischemia.

transcranial magnetic stimulation;cerebral ischemia;synaptophysin;long-term potentiation;learning and memory

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.01.002

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院 a.康复医学科，b.泌尿外科武汉430030

2.华中科技大学同济医学院附属中西医结合医院针灸科武汉430022

湖北省自然科学基金（No.2012FFB024 32）；国家自然科学基金（No.81171858）

2014-06-06

韩肖华hanxiao1470@sina.com