细菌生物膜的结构及形成机制的研究进展

祝司霞

（攀枝花学院医学院形态学教研室，四川攀枝花 617000）

细菌生物膜的结构及形成机制的研究进展

祝司霞

（攀枝花学院医学院形态学教研室，四川攀枝花 617000）

生物膜；结构；形成机制

难以被摆脱和清除，而且对抗生素的抵抗力比浮游细菌增强很多倍，所以BF感染性疾病非常顽固，经常导致慢性化，难以治愈。对BF的基本结构及形成机制的探讨是研究BF的最基本的环节，

可以为更深入地揭示BF的耐药性、抵抗性以及如何预防BF的形成，更好地清除、消灭BF，彻底治愈疾病提供理论依据。

1 BF的定义及特点

1.1 BF的定义 自然界中，99.9%的细菌以BF形式存在，细菌BF是细菌及其分泌的胞外多糖等物质所形成的膜状细菌群体，对环境的适应能力极强，是细菌抵抗外界恶劣环境的一种自我保护形式，与浮游细菌不同，它是微生物群体的聚集，细菌之间借信号分子相互交流［2］。

1.2 BF的特点

1.2.1 耐药性极强 研究表明，成熟BF内细菌耐药性比浮游细菌高500～5 000倍［3］，这是由于BF具有屏障作用，防止抗生素的渗入，BF中的细菌生长速度较慢，对抗生素不敏感，有的细菌能分泌抗生素分解酶，产生抗生素外排泵，甚至基因表达改变，导致细菌产生强大的耐药性。耐药性是临床感染迁延不愈，病原菌难以彻底清除的重要原因［4-5］，近年来，抗生素虽然广泛应用，但仍然无法控制细菌的感染，尤其是在小儿、老年人、长期患病、免疫力低下的患者，或重症监护病房中，BF引起的感染更为棘手，所以目前抑制BF药物的研究受到广泛重视。

1.2.2 抗吞噬性极强 对于BF细菌，由于包裹着细菌的黏性基质将细菌和机体免疫系统隔开，BF细菌可抵抗吞噬细胞的吞噬，逃避宿主免疫系统的攻击，使感染慢性化并难以控制［6］。研究显示，藻酸盐的过度表达可创造水合微环境，促使黏液型铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）BF的形成，可保护PABF内的细菌免受γ-干扰素介导的巨噬细胞攻击，具有免疫抑制作用［7］。所以干扰BF形成过程中藻酸盐等关键基因的表达，有可能降低BF细菌的抗吞噬能力。

1.2.3 黏附性极强 BF可以通过各种复杂的机制牢固地黏附在宿主细胞或植入人体的医用器械表面，要想用常规的清洗措施清除BF基本无效，从而造成医院的交叉感染。近年来，随着各类移植性生物材料（如人工瓣膜、血管支架、静脉导管及关节假体等）在临床上应用的日益增多，附着在移植物表面的细菌BF感染也日益增多。因此，如何防止细菌形成BF及彻底清除BF，逐渐成为医院感染控制的目标和研究热点。

目前去除BF可以用蛋白酶和纤维素酶等多种酶共同作用的方法，酶能降解信号分子或破坏BF的群体感应系统；此外，Davies等［8］观察到绿脓杆菌能产生一种叫顺-2-癸烯酸的生物表面活性剂，它能使成熟的大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等的BF结构疏松，易于去除；徐卓佳等［9］研究表明，裂解性噬菌体ΦS1可以将荧光假单胞菌85%的BF去除，将几种噬菌体联用效果可能更好，这种方法具有天然、无毒、特异性强的优点；此外，滴流式反应器可用于血流感染BF的去除，膜式反应器可用于筛选不同表面活性剂对BF的去除效果。

2 BF的结构

细菌BF是有三维结构的菌细胞群体，其中少部分是细菌，大部分是细菌分泌的胞外聚合物，包括胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）和蛋白质等，EPS等构成结构精细的网络或框架，支持菌体细胞、菌体互相黏连附着在框架表面。Flem-ming等［10］认为，细菌BF结构类似于人类居住的社区，其中房屋是胞外聚合物，细菌是居民，住在房屋中，这种结构坚实稳定，不易被破坏，使细菌的存活能力显著提高。Moscoso等［11］用低温扫描电子显微镜观察肺炎链球菌BF，发现有小而薄的细丝连接细菌，细菌团簇之间有水通道孔，类似蜂巢的结构。

Lenz等［12］认为BF的结构具有不均质性，分表层菌和里层菌，不同层面的细菌理化特性差异显著，表层菌代谢活跃，分裂较快；里层菌则反之。由于细菌所处微环境不同，所以导致相同的细菌其基因表达模式不同，因此，不同细菌或同一细菌所处环境不同所形成的BF存在结构差异，或疏松，或致密，厚薄不均。但目前为止尽管人们对BF的结构开展了很多研究，仍不十分清楚。

3 BF的形成

3.1 形成过程 BF的形成受到环境因素的影响，主要受营养成分的影响，此外与细菌所处的温度、pH、水流冲刷力、介质表面特性、渗透压和氧化还原电位等有关。在合适的条件下，任何细菌均能形成BF。形成BF的能力因细菌而异，有的形成速度快，有的速度慢。BF的形成主要经历黏附、发展、成熟和播散等过程，在不同的阶段，BF的化学物质的组成比例、结构、形态、对抗生素的敏感性和清除的难易度等差别很大。

3.1.1 菌体黏附 此期细菌黏附到宿主表面，菌体互相聚集，形成一层薄膜。尤其是在组织病变或体内有植入的生物材料时，一些含有多糖、蛋白质或无机物质的体液，如尿液、血液、胃肠道液、唾液等就会很快覆盖到这些病变组织或生物材料表面，形成一个2～10 nm的具有吸附能力的调节膜［13］，细菌会特异性黏附到调节膜表面的蛋白或多糖受体上。黏附是BF形成的关键步骤，黏附后的细菌不容易被流体冲走，如尿道中的大肠杆菌BF黏附牢固，不容易被尿液冲走。（1）非特异性黏附：细菌在物体表面定植的起始步骤，通常包括细菌向物体表面的移动和微黏度的改变，而微黏度的改变会引起细菌在靠近表面时移动性下降，这时细菌在静电引力和范德华力的作用下，会短暂、可逆地趋向表面［14］。此外，菌体表面的附属结构及黏附因子也有助于菌体的黏附聚集，鞭毛的运动使细菌克服与宿主表面的斥力相互接触，普通菌毛促使菌体的黏附。细菌在与物体表面的接触过程中，经历了细胞形态和鞭毛合成的巨大变化，这牵扯到基因表达调控的巨大变化，细菌一旦黏附，其鞭毛合成可能被完全抑制。此期在BF的形成过程中最弱。（2）特异性黏附：主要是细菌与宿主表面进行受体和配体间的特异性和选择性的结合，宿主表面提供蛋白、糖蛋白和糖脂等受体，细菌借助特定蛋白黏附其上。张晓雷等［15］通过构建尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic escherichia coli，UPEC）黏附素基因iha敲除缺陷株，分析iha基因缺失对UPECBF形成的影响，结果表明基因缺陷菌株与野生菌株相比BF形成能力降低（P＜0.01），提示iha基因及其编码产物参与UPECBF的形成，通过抑制该基因的表达有望为控制尿路感染提供新的靶点。李芳等［16］则认为细菌在黏附过程中，主要产生EPS藻酸盐，能连接细胞，使BF增厚，所以可以通过影响藻酸盐合成过程中重要基因的表达，降低藻酸盐合成限速酶GMD的活性等，来达到抑制BF形成的目的。此阶段尚未形成成熟的BF，细菌抗力不强，容易去除，选择此时用药治疗感染性疾病，效果相对较好。

3.1.2 BF的发展 初步形成BF后，游动菌体不断黏附其上，已附着的细菌大量繁殖，众多菌体分泌大量EPS，将细胞凝结成团块状，即微菌落。不同细菌或同一细菌的不同菌株微菌落的形成能力不同，叶联华等［17］在探讨ica操纵子在聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材料表面表皮葡萄球菌BF形成中的作用时发现，表皮葡萄球菌ica操纵子阳性菌株可以增加PVC材料表面BF的形成能力、细菌群落数量及BF厚度。

此期BF不断加厚，具有刚性与柔韧性，细菌对不良环境的抵抗力更强，对抗生素的敏感性降低，导致难治性感染的发生。

3.1.3 BF的成熟 即微菌落进一步连接、扩大的过程，大量微菌落使细菌BF加厚并逐渐成熟。微菌落类似蘑菇状，微菌落之间有相互连接的运送代谢产物、营养和废物的通道，此时，BF是一个高度有组织的特殊功能性结构群落。

3.1.4 细菌播散 BF成熟后，有些细菌能自我分离或受到外界作用力而从BF中脱落成为游离菌［14］，游离菌可以进入血液引起菌血症，或播散到它处寻找新的宿主表面并黏附，从而开始新的BF形成周期，导致疾病恶性循环。

3.2 形成的调控机制 在BF的形成过程中存在信号转导调控机制，目前学术界比较公认的是细菌群体感应（quorum sensing，QS）系统。QS是指细菌根据群体密度的大小利用信号分子进行信息交流，并调控特定基因的表达使群体行为协调。细菌合成并分泌的一些特定信号分子也称为信息激素或自身诱导素（autoinducer，AI），AI主要包括作用于革兰氏阴性菌的N-酰基高丝氨酸内酯类（acylhom oserine lactones，AHLs）、作用于革兰氏阳性菌的寡肽类分子AIP（autoinducing peptide）以及革兰氏阴性和阳性细菌间的种间通用信号分子AI-2（autoinducer-2）等［18-19］。QS系统能帮助细菌黏附，进而分泌大量的EPS等物质，以形成稳定的BF，还能使菌体感受自身密度的变化，随着细菌密度的增加信号分子也增加，当细菌密度达到一定阈值时，信号分子与细胞膜或细胞质中的受体结合，某些基因被激活并表达，然后发出信号并协调群体行为，避免因细菌过度生长而造成空间和营养物质的缺乏，QS系统使细菌具有社会化特征［20］。因此，抑制群体感应系统可以防止细菌黏附或使EPS等物质的分泌减少，从而干扰BF的形成，成为控制感染的新方向。

综上所述，细菌BF与浮游细菌相比有许多不同的特性，给临床治疗带来很大的麻烦。近年来，随着相关学科的发展及研究技术的进步，BF的研究已经取得了较大进展，许多问题被解决，但同时有关细菌BF的很多谜团仍未破解，今后的研究重点应放在BF形成的遗传物质基础和基因调控机制上，从基因组水平和蛋白组水平来构建BF形成模型，利用基因敲除等分子技术，揭示BF形成不同阶段的分子机理，进一步阐明BF与机体免疫关系、BF耐药机制等问题，并为预防、控制和去除BF建立有效的策略，从而减少BF感染性疾病的发生。

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1008-2344（2015）02-0115-03 doi：10.3969/j.issn.1008-2344.2015.01.020根据美国NIH统计，超过80%的人类感染性疾病是由细菌生物膜（biofilm，BF）介导的［1］。BF的黏附能力极强，可以黏附在人体和各种医用材料上（如人工关节、人工瓣膜、各种导管等），

2014-11-10