方法验证资料对药品无菌检查的影响

贵州省黔南州食品药品检验所（558000）罗书香

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其品种是否无菌的一种方法[1]，因而药品无菌检查是规定灭菌制剂（即注射剂、眼用制剂、植入剂等无菌药品）质量检查中重要的检验项目。历版中国药典均收载药品的无菌检查方法，《中国药典》2005年版开始增加了无菌检查法的方法验证试验，规定“当建立药品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明采用的方法适合于该药品的无菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证”。供试品无菌检查的培养时间也由7天修订为14天[2]。经过方法验证以确定所采用的方法适合于该产品的无菌检查，以保证药品无菌检查结果的可靠性。同时国家药典委员会《关于执行（中国药典）2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明》中明确“药品检验所在进行具体品种检验时，应请相关药品生产企业提供方法验证资料并进行审核”，确保药品检验顺利进行和完成。九年来，方法验证在促进药品无菌检查科学化方面起到了积极的推动作用，但部分验证资料书写的不规范，在一定程度上也直接影响到相应药品品种无菌检查的顺利进行。为了进一步完善药品无菌检查的方法验证工作，规范验证资料的书写，顺利进行和完成药品无菌检查。本文将我所近三年的药品无菌检查工作状况并结合收集到的方法验证资料进行分析和讨论。

1 基本情况

1.1 近三年来，黔南州食品药品监督管理局稽查局抽取送交我所检验的注射剂药品481批次，我所完成无菌检查397批次，占82.54%。因验证资料原因未能进行检查的84批次，占17.46%（其中缺验证资料65批次，占13.51% ；取得的验证资料不清、方法不明者5批次，占1.04.% ；抽取样品不够者14批次，占2.91%）。

1.2 在收集的416份无菌检查方法验证资料中，仅提供方法描述及验证结论而未提供具体验证内容的109份，占26.20%；供试品检验量不确切的39份，占9.38%；阳性对照菌不确定的32份，占7.69%；验证结论表述不清的28份，占6.73%；资料不清、方法不明的5份，占1.20% 。

2 分析和讨论

2.1 验证资料索取难，使药品检样未能进行无菌检查，影响到药品质量的综合评判。黔南州药品检验监督工作是由州食品药品监督管理局稽查局抽取药品检样送交到州食品药品检验所业务科，再分发到相关检验科室检验并出具检验报告。州所业务科在收到药品检样时，会及时向药品检样生产企业联系索取相关药品的无菌检查法的方法验证资料，大多数药品生产企业都能给予积极的支持和配合，及时传真或寄来方法验证资料。但少数药品生产企业有的电话很难拨通，拨通了又无人接听，或是药企相关人员接听了电话，并答应很快传真或寄出方法验证资料，可十天半月还未收到资料，再联系仍无果。在481批次药品检样中，因缺方法验证资料而未能进行无菌检查的检样就有65批次，占13.51%。

2.2 相当一部分药企提供的无菌检查验证资料较为凌乱、很不得要领，未能反映试验方法的完整性和可行性。其提供的方法验证资料用很大篇幅叙述方法验证的目的、范围、验证依据、环境、人员及仪器设备、验证菌种，培养基来源，阳性对照菌的来源及菌液的制备等，在检测方法下，则简单地给3批样品的培养结果表格。方法验证的结论却是：“结果：说明供试品在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，无菌分析方法验证符合规定。” 或“本品按《中国药典》2010年版无菌检查法验证试验，无菌检查符合规定。”或“验证小组对验证结果进行综合评审，做出验证结论，并发放验证合格证书。” 而我们需要了解的检验方法是直接接种法或是薄膜过滤法？检验量是多少？薄膜过滤样品后是否需要冲洗（冲洗液名称？冲洗量多少？），阳性对照菌用什么菌等最基本的信息均没有明确地反映在方法验证资料中。在416份方法验证资料中存在样品检验量不明确者39份，占9.38%；阳性对照菌不确定的者32份，占7.69%；验证结论表述不清的28份，占6.73% 。我们只能多次电话联系一一确认，才能决定是否对药品检样进行无菌检查。这无形中占据了我们很多工作时间和精力，影响了药品检样的无菌检查工作进度。

2.3 有的方法验证资料在复印、传真过程中缺页少行或字迹模糊难辨，致方法不明晰，可操作性差。电话联系药企，药企相关人员既说不清楚，又借故推托、拖延时日，就是给不了明确肯定的答复。我们只有无奈地放弃对该药品检样的无菌检查。这在416份验证资料中有5份，占1.2% 。

2.4 部分方法验证资料验证方法欠妥或有误。如穿心莲注射液、鱼腥草注射液，某些药企的方法验证不采用薄膜过滤法却采用直接接种法（分别取供试品1ml，直接接种到每管装有15ml培养基的管中）。对含有抑菌成分的制剂采用直接接种法进行无菌检查时，由于其抑菌活性对污染菌的抑制或可杀灭作用，有可能会造成假阴性的结果而放过不合格药品。若采用薄膜过滤法通过冲洗就可以最大限度地降低抑菌成分的作用，培养结果比直接接种法更加灵敏和真实。另外，直接接种法因所有成分都在培养基中一起培养，供试品浓度高时会影响培养基的澄清度，无法观察结果[3]。在《中国药典》中，无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，在建立某一药品品种的无菌检查方法时应优先采用薄膜过滤法[1]。还有，维生素B1注射液和维生素K1注射液这两个品种，有的药企不优先采用薄膜过滤法而采用直接接种法，也令人费解。

此外，有个别药企相关人员连检查方法的概念都不清楚。如某药企生产的一个口服液制剂——康复新液，该药品应做的是微生物限度检查，可寄来的却是该药品的无菌检查法的方法验证资料。可见，方法验证工作任重道远。

2.5 部分方法验证资料中确定的供试品检验量过大（达120支），影响药品检样的无菌检查项目检验。由于这些方法验证资料确定的供试品检验量过大，稽查局按常规抽取的样品，在不安排做其他主要检验项目的情况下，都不够做无菌检查，加上药品经销商库存样品量有限，稽查局未能再次补抽样品而使无菌检查项目缺检。此种情况在416份验证资料中有14份，占3.37% 。在药品无菌检查中，直接接种法除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定[1]，也就是10支（瓶）左右[若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则用的供试品支（瓶）数会更少]，分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基，总量也就是20支（瓶）。采用薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种法的供试品总量，按每一种培养基每一筒过滤接种10支（瓶）计算，采用三筒一套全密闭无菌的集菌培养器则需要供试品30支（瓶）。

2.6 同一药品品种，不同的药企其方法验证资料的无菌检查法不一样。同是采用薄膜过滤法，但在检验量，阳性对照菌，冲洗液及数量，加酶方式及数量等方面各药企的方法验证也差别甚大，让人感到乱象丛生，影响到药品无菌检查的工作质量和评判标准。以注射用头孢他啶为例：

A药企：检验量30支，以大肠埃希菌为阳性对照菌，用0.1%蛋白胨水800ml冲洗，在硫乙醇酸盐培养基筒中需加入240万U·ml-1青霉素酶1ml。

B药企：检验量30支，以大肠埃希菌为阳性对照菌，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液600 ml冲洗，在硫乙醇酸盐培养基筒中需加入240万U·ml-1青霉素酶2ml。

C药企：检验量10支，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，用0.9%氯化钠900 ml冲洗，在培养基筒中需加入300万U·ml-1青霉素酶2ml。

D药企：检验量10g，以大肠埃希菌为阳性对照菌，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1000 ml冲洗，在硫乙醇酸盐培养基筒中需加入300万U·ml-1青霉素酶1ml，静置15分钟。

E药企：检验量30支，以铜绿假单孢菌为阳性对照菌，用0.1%蛋白胨水1500ml冲洗。

F药企：检验量30支，以大肠埃希菌为阳性对照菌，用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液600 ml冲洗。

3 建议

3.1 我国的药品无菌检查法的方法验证试验是依据《中国药典》2005年版及附录的要求和方法进行的。有了依据，方法验证资料的内容可简明扼要叙述，操作方法则要清晰明了、可靠、可行，验证结论要准确清楚，要有特指性和肯定性。方法验证结论必须明确包含经验证后的无菌检验方法是直接接种法或是薄膜过滤法、供试品检验量、供试液制备、薄膜过滤（几个滤筒）样品后是否需要冲洗（用何种冲洗液及冲洗量）、阳性对照菌等最基本的要素。例1：经验证，注射用奥美拉唑钠（60mg/支）的无菌检查采用薄膜过滤法，方法为：取供试品20支，分别加适量的灭菌注射用水溶解，作为供试液。使用三筒一套全密闭无菌的集菌培养器，先用少量0.1%无菌蛋白胨水溶液过滤湿润滤膜，再将供试液滤过培养器，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗滤膜三次，每膜每次50ml，冲洗毕，滤干，将硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基滤入相应的培养筒，每筒100ml。以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。置规定温度下的培养箱中培养 14天，逐日观察，应符合规定。例2：经验证，碳酸氢钠注射液（10 ml/支）的无菌检查采用薄膜过滤法，方法为：取供试品10支，使用三筒一套全密闭无菌的集菌培养器直接过滤，不需冲洗，滤干，将硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基滤入相应的培养筒，每筒100ml。以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。置规定温度下的培养箱中培养 14天，逐日观察，应符合规定。

3.2 药品无菌检查法的方法验证试验工作是一个极繁杂耗时的操作过程，周期长，干扰因素多，控制不好很难达到验证的要求和效果。这就要求方法验证试验单位必须具有良好的方法验证试验条件和资质，要求试验人员严格按照操作规范进行操作，减少和避免方法验证的结果误差。国家相关决策机构可通过考察调研，指定具有方法验证试验资质及条件过硬、实力雄厚的部分科研检验机构及大型药品生产企业分别承担药品标准中部分品种无菌检查法的方法验证。其他药品生产企业在药品品种组分及检验条件不变的前提下，就可以不再进行方法验证。这样可避免各个药品生产企业重复多次的验证造成验证方法的不统一和验证资料的不规范现象，也节省了大量的人力物力。更为重要的是方法验证工作质量得到了保证，验证的方法可靠可行，方法验证资料可资源共享，确保药品质量安全有效。