牛大肠杆菌病的病原学检疫

谷作霖

(黑龙江省密山市畜牧兽医局动物检疫站,黑龙江密山 158300)

牛大肠杆菌病的病原学检疫

谷作霖

(黑龙江省密山市畜牧兽医局动物检疫站,黑龙江密山 158300)

大肠杆菌主要寄居于人和动物的肠道内,在自然界分布广泛,属于条件致病菌。大肠杆菌能通过消化道使人类和畜禽发生感染和中毒。对大肠杆菌病的防治和流行病学调查都依赖于对病原的及时准确的检测和鉴定。

大肠杆菌病;病原学检疫

1 病料采集和处理

为了分离到病原性大肠杆菌，应于急性期采集病料，可采集粪便、血液、分泌物；病牛各种脏器如心、肝、脾、肾、淋巴结等病料，用选择性培养基分离培养。可对分离培养物进行细菌染色镜检检查。

2 细菌分离

将采集的病料样品作画线培养，接种于普通琼脂平皿，麦康凯培养基、远藤氏琼脂培养基、血液琼脂平皿上，于37℃培养24h。大肠杆菌在普通营养琼脂培养基上，可形成光滑型菌落（S），直径2～3mm，表面光滑，微隆起，湿润，半透明带淡灰色菌落易分散于盐水中。也可形成粗糙型菌落（R），菌落较大，干燥，表面粗糙，边缘不整齐，在生理盐水中容易发生自凝集。此外，还有一种黏液型菌落，这种型菌落常见于有荚膜的菌株，在培养基中含有糖类或在室温中放置易出现黏液型菌落。在麦康凯和远藤氏琼脂培养基上生长良好，可形成红色菌落，是由于大肠杆菌能分解乳糖所致。某些大肠杆菌菌株在血液琼脂平皿上可出现β溶血环。

3 细菌学检查

挑取上述菌落涂片、染色、镜检，如菌体为革兰氏阴性，卵圆形或杆状，大小为1～3μm×0.4～0.7μm，单独或成双存在，无芽孢，无荚膜，大多数能运动，具周身鞭毛，则可初步确诊；多数菌株在适宜培养条件下可以出现菌毛，菌毛是取得营养、传递质粒的通道，也是噬菌体接触的地方，还能使某些动物的红细胞发生凝集。这种凝集性能有的菌株常因甘露糖存在而不出现，称为甘露糖敏感株，简称为MS株；另一些菌株称之为甘露糖抵抗株，简称为MR株，即有甘露糖时仍照样凝集。

4 生化特性

大肠杆菌对氧化酶试验阴性，不利用柠檬酸盐，通常利用醋酸盐作为碳原。还原硝酸盐，产生靛基质，不产生硫化氢。MR试验阳性，VP试验阴性，不液化明胶，不分解尿素；所有菌株能分解葡萄糖、甘露醇、产酸产气，70%～90%菌株分解蔗糖、乳糖、卫矛醇、水杨苷、山梨醇、阿拉伯胶糖、棉籽糖、鼠李糖、麦芽糖、木糖和蕈糖。

5 分离培养物的鉴定

经选择性培养基（麦康凯、远藤、伊红美蓝培养基）从病牛体内分离培养获得的特征性大肠杆菌菌落，未必都是病原菌。所以需对分离的菌落进行生化特性试验、病原性鉴定（肠毒素测定，黏附素测定，回归动物试验）以及最后作血清学定型试验。

5.1 大肠杆菌热敏肠毒素（LT）的检测

（1）热敏肠毒素的制备：将被检大肠杆菌接种到1ml的Ca-YE-I培养基，37℃培养18h后，将此1ml培养物加入到盛有15ml同样培养基的100ml三角瓶中，仍置37℃培养18h后取出，加入1%硫柳汞0.15ml，其硫柳汞的终浓度为万分之一，冰箱中过夜杀菌，次日以3500转/min离心20min，取上清液，供热敏感肠毒素试验用，此液应新鲜制备，在冰箱中保存不宜超过3d。

（2）热敏感肠毒素的检测

A.兔皮肤蓝斑试验。将成年健康家兔的背部剃毛，或在背部剪毛后涂以脱毛剂（硫化钠8g、淀粉7g，白糖4g，甘油5g，硼砂1g，水75ml混匀）5min后用温水洗净，该部即脱毛。将无毛皮肤区分成15mm见方的小格，在小格的中央皮内注射检测的滤液0.1ml，每一被检液作一个重复；在邻近另一方格中央皮内注射未接种细菌的CaYE-I培养基0.lml作为培养基对照；另取加热（56℃10min）的被检滤液接种到另一方格，作为毒素热敏对照。24h后向试验兔耳静脉注射1%伊文思蓝生理盐水液4ml，6h后观察至24h为止。蓝斑直径大于7mm以上者为阳性，培养基对照及毒素热敏对照，均应为阴性。

B.乳兔口服试验。用7～9日龄乳兔，每克体重口服被检热敏毒素0.05ml（用细、圆头塑料管插入食道投入），5h后将乳兔麻醉死亡，剖检，并称肠道重（X）与剩余体重（Y），当X：Y≥0.085为阳性，因热敏毒素能引起肠道炎症、水肿；如X：Y≤0.074为阴性；比值介于0.073～0.084为可疑。

C.兔回肠结扎试验。取体重2kg以上的健兔，给水不喂食物饥饿2d。以外科手术切开腹壁，自盲肠游离端处的回肠开始，沿向心方向结扎，每结扎8～10cm一段，间隔3～5cm，再结扎8～10cm一段，间隔3～5cm，又结扎8～10cm一段……。向其中一段肠腔注射被检热敏肠毒素1ml，向另一段肠腔注射1ml培养基作为对照。注射完后缝合，给饮水不给食物饥饿12h后，将兔扑杀，测结扎肠段内的液体量（ml）与结扎肠道长度（cm）的比，ml：cm＞l者为阳性，培养基对照段的比值应小于1。

5.2 黏附素测定

取回肠前段，经反复冲洗之后，将黏膜制成涂片，用革兰氏法染色，镜检。如观察到有大量革兰氏阴性大肠杆菌样细菌，即为阳性。也可将冲洗的回肠前段，制成切片、染色、镜检；如无黏附素的大肠杆菌样细菌则易被冲掉；具有黏附素的大肠杆菌，一般均为产LT毒素的致病大肠杆菌。

5.3 回归动物试验

将分离获得的大肠杆菌18h肉汤培养物以0.5～1.0ml剂量口服感染未吃初乳的新生牛犊。如病犊发热，精神委顿，排水样稀粪，常致突然死亡，即可做出初步诊断；此时从尸体的内脏和组织里都可分离到单一血清型的大肠杆菌纯培养。

[1] 李升团，韩光红.大肠杆菌O157：H7感染的病原学与流行病学[J].解放军预防医学杂志，1997，（5）：387-389.

[2] 冉旭华，王密，闻晓波，等.大肠杆菌病病原学检测方法的研究进展[J].黑龙江八一农垦大学学报，2008，（2）：51-54.

谷作霖（1971—），男，大专，兽医师，主要从事动物检疫检验工作。