猪喘气病的实验室诊断

修晓宇董 贺胡华英

(1.吉林省前郭县动物疫病预防控制中心,吉林前郭 138000; 2.吉林省前郭县八郎镇畜牧兽医站,吉林前郭 138000)

猪喘气病的实验室诊断

修晓宇1董 贺2胡华英1

(1.吉林省前郭县动物疫病预防控制中心,吉林前郭 138000; 2.吉林省前郭县八郎镇畜牧兽医站,吉林前郭 138000)

引起猪喘气病的病原是猪肺炎支原体,是一种慢性传染病,主要的临诊表现是咳嗽与喘气。剖检变化为肺的心叶、尖叶、脑叶发生实变,以及肺淋巴结增生。本病是规模化养猪场常见疫病之一,也是无特定病原猪场要求净化的疫病之一。

猪喘气病;诊断

1 临诊特点

本病的主要临诊症状是体温不高、咳嗽与喘气，并随运动加重，慢性病猪生长发育迟缓或死亡，造成饲料和人力的大量浪费。主要病理变化是肺的心叶、尖叶、膈叶前下缘及中间叶有实变区，呈“虾肉样”。肺门和纵隔淋巴结肿大。

2 实验室检查

2.1 检验方法

（1）X射线诊断：被检猪正位及侧位保定，用X光机透视，观察肺部是否有阴影。

（2）病原学检查：A.病料的直接触片镜检：在无菌条件下取急性死亡的猪的病变比较明显的肺组织触片，用姬姆萨染色后在显微镜下观察其形态学特征。B.猪肺炎支原体的分离与鉴定：先进行病料的采集与处理。用无菌手术采集肺脏实变与正常区交界处的组织（应包括支气管），也可用棉拭子收集气管支气管分泌物和呼吸道洗液，制成10%悬液。用含有1～2ml的选择性培养基（含抗猪鼻霉形体血清）和非选择性培养基的试管，分别作10-1至10-6稀释。

猪肺炎霉形体的分离与纯化可采用以下方法：a.猪肺炎霉形体的液体培养基的分离培养：将含有稀释病料的液体培养基放置于37℃中培养，每天观察pH值的变化，再将产酸的培养物移植于新鲜的液体培养基中。如此多次移植，直到培养1～2d时培养基pH降至约6.8，表明已适应生长为止。b.猪肺炎霉形体在固体培养基上的培养：在A260琼脂平皿上加0.1毫升待纯化的肉汤培养物，使流淌均匀，吸干多余的液体，置于含5～20%二氧化碳的潮湿大气中。在37℃中培养，观察菌落形态。c.猪肺炎霉形体的纯化：一般采用单菌落移植法，将形成的菌落反复移植3次。

猪肺炎霉形体的鉴定可从以下几方面进行：a.猪肺炎霉形体的形态学观察。b.猪肺炎霉形体的生化特性鉴定：主要进行葡萄糖代谢实验，水解精氨酸还原四氮唑实验，磷酸酶活性实验等。c.生长抑制实验：用已知的抗血清对霉形体分离物进行菌落的生长抑制实验，是国际霉形体分类委员会推荐的法定血清方法之一。其方法如下：取新鲜制备的琼脂平皿，厚度不小于4mm，在37℃中，底与盖分开放置30min，使水蒸气挥发。然后将对数期霉形体肉汤培养物稀释100倍，其浓度应约为10-2～10-6CFU/ml（能在琼脂平皿上产生一个菌落的霉形体悬液的最高稀释度即为一个CFU），然后接种100μl至琼脂平皿上，用“L”型玻棒涂布均匀后，短暂放置室温中使接种物吸收。用灭菌镊子将选定的预先准备好的抗血清滤纸片（直径5mm，已吸收了约20μl抗血清，并已干燥）小心的放置于接种后的平皿上，纸片间保持1.5～2cm的距离；按所测定霉形体的生长需要，选择培养条件与时间，然后在低倍显微镜下测量抗血清纸片抑菌圈的宽度。

（3）血清学检查：A.微量间接血凝实验：在96孔微量反应板上，吸取稀释液25μl加入第一至六孔中，每份血清占一排孔，然后取被检血清25μl于第一孔中，以后做对倍稀释至第六孔，第六孔遗弃25μl。每孔中滴加25μl2%致敏红细胞。同时各设一排阴性猪血清和抗原致敏红细胞对照。放置于微型震荡器上震荡30s后，室温中（最适温度18～25℃，夏天宜放置4～8℃冰箱）静置2h，观察记录。B.试管乳胶凝集实验：取标准血清、待检血清和生理盐水与猪肺炎支原体培养物混匀，放置37℃培养24～48h，Wright式染色，1000倍显微镜下观察结果。C.酶联免疫吸附试验：抗原的包被、洗涤，加入被检猪血清，加入酶标抗猪的IgG，加入底物显色，判断结果。

2.2 判断标准

（1）X射线诊断：如果在猪的肺视野内侧面及心膈角区观察到不规则的云絮状阴影，中等密度，边缘模糊，即为病变，结合病猪的临诊症状即可确切诊断。

（2）病原学检查：A.病原的形态、培养结果观察：病料经姬姆萨染色后观察到呈典型的两极状、车轮状和戒指状等多形态的猪肺炎霉体为阳性。病料经稀释后在液体选择性培养基上生长，pH值降至6.8，转入液体培养基上培养，长出典型的油煎鸡蛋状菌落，为阳性。B.病原的生化特性：水解精氨酸（－），磷酸酶（－），还原四氮唑（－弱），解朊活性（－），血细胞吸附（－）。C.生长抑制实验：抑菌圈的宽度大于1mm者为阳性；小于0.5mm者为阴性；界于二者之间者即为可疑。

（3）血清学试验：A.微量间接血凝实验：a.如果抗原致敏红细胞对照样无自凝现象，阳性猪血清抗体价＞1：20（＋＋），阴性对照猪血清抗体价＜1：5，表明反应正常进行。b.判定记录：被检血清抗体效价≥1：10（＋＋）者，判为阳性；被检血清抗体价＜1：5者判为阴性；被检血清抗体价介于二者之间者，判为可疑。B.试管乳胶凝集实验：菌体出现凝集反应判断为阳性；菌体不出现凝集反应判断为阴性。C.酶联免疫吸附试验：反应结束后用72型分光光度计在495纳米的波长下测定各反应孔中溶液的光密度值。凡试验血清光密度值高于阴性血清1.5倍以上者判定为阳性。

[1] 姜波.猪喘气病的诊断与防治[J].现代农业科技，2008，（17）：278-279.

[2] 郑行义，张天双，吕忠辉，等.猪喘气病的诊断与防治[J].养殖与饲料，2006，（1）：37-38.

修晓宇（1984—），男，助理兽医师，本科，主要从事内容疾病预防与控制、实验室检测检验、技术管理与应用研究指导工作。