肝细胞癌患者外周血单个核细胞Foxp3 mRNA水平变化*

杨智，陈洪涛，吴诗品

肝细胞癌患者外周血单个核细胞Foxp3 mRNA水平变化*

杨智，陈洪涛，吴诗品

作者单位：518020广东省深圳市暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院感染内科

第一作者：杨智，女，36岁，硕士研究生，主治医师。主要从事感染性疾病临床与基础研究。E-mail:ccyangzhi@sina.com

【摘要】目的检测初发现未治疗肝细胞癌（HCC）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中Foxp3 mRNA水平变化及其与血清AFP水平的关系。方法在HCC患者60例和健康人20例，采用RT-PCR法检测PBMCs中Foxp3 mRNA水平，常规检测血清AFP水平。结果HCC患者和健康对照组外周血Foxp3 mRNA水平分别为（0.976± 0.073）和（0.772±0.083），差异有统计学意义（P<0.01）；经Pearson相关性分析显示，HCC患者外周血Foxp3 mRNA水平与AFP水平呈正相关（r＝0.226，P＝0.025）。结论HCC患者PBMCs中Foxp3水平明显升高，对肿瘤的发生发展可能具有一定的预测作用。

【关键词】肝细胞癌；Foxp3；外周血单个核细胞；甲胎蛋白

在常见的恶性肿瘤中原发性肝癌全球排名第五,在常见死亡原因中排名第三[1]，每年大于60万患者死于该病[2]。中国是肝癌的高发国家，在实体肿瘤中死亡率排第二位[3]。因其具有恶性度高、生长快、易复发和易出现远处转移等特点，早诊断早治疗对患者预后的影响极大。因此，机体内早期出现并具有高度特异性的血清学指标对发生肝癌的预测并早期诊断尤为重要，且能作为监测肿瘤复发的手段。目前，针对肝癌的血清学诊断应用最广泛的肿瘤标志物有甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白异质体（Lectinreactive alpha-fetoprotein，AFP-L3）等。AFP的合成部位主要是在啮齿动物及人类胚胎的肝脏，但也可在卵黄囊及胃肠道。因此，生殖系统肿瘤及大量非癌症肝病患者均可有AFP的升高，说明AFP的升高并非肝癌所特有，其诊断肝癌患者的阳性率仅为70%。鉴于AFP的这一非特异性表现，使其检测对肝癌患者的早期诊断及术后复发的早发现存在不确定性。最近有报道指出，肝癌患者居高不下的术后复发率是导致患者难以长期生存的重要原因[4，5]。因此，我们急于寻找其它能早期提示肝癌发生的标志物，以协同AFP检测，提高肝癌的早期诊断率。肿瘤形成的基础与机体免疫内环境的改变和肿瘤细胞免疫逃逸能力增强有关。当机体免疫力减弱，少量的肿瘤细胞转化后不能被有效地免疫杀伤，机体就可能会发生肿瘤。肿瘤患者免疫防御损伤及免疫功能在疾病的早期已经开始发生变化，如能对肿瘤形成过程中有重要免疫调节作用的标志物进行检测，可比AFP更早预测肝癌的发生。CD4+CD25+调节性T细胞（Regulatory T cells，Tregs）为1995年Sakaguchi et al[6]首次报道的T细胞亚群,以表达CD4+和CD25+为表现型，能抑制CD4+、CD8+T细胞的效应功能，在维持免疫耐受中有重要作用。通过不同机理，Treg细胞可以抑制一系列免疫反应，最后可以促使肿瘤细胞免疫耐受、逃逸机体免疫系统的打击。目前，国内外多项研究表明在肝细胞癌（HCC）患者外周血和肿瘤局部Treg细胞比例增加[7]，对肿瘤的发生、发展起着重要而不可忽视的免疫病理作用。Zhao HQ et al[8]对进展期HCC患者Tregs细胞的作用进行了Metal分析，这一研究筛选了23篇文献，其中包括1279例HCC患者和547名健康人，结论显示，Tregs参与HCC的发生，外周血循环和HCC组织中Tregs细胞均比健康对照组明显升高，且与肿瘤大小及AFP水平呈正相关。另有研究亦发现Treg细胞的多少与血清AFP水平呈正相关，提示Treg细胞联合AFP检测有可能成为肝癌术后随访的特异性指标，对预测肝癌复发及预后有参考价值[9]。而Foxp3只特异性地表达于CD4+CD25+Tregs细胞,是控制其发育及功能的关键基因。因此，可以将Foxp3作为鉴定CD4+CD25+Tregs细胞的一个特异性标志物[10，11]。CD4+CD25+Tregs细胞亦高表达抑制性分子CTLA4和PD-L1，以及抑制性细胞因子IL-10 和TGF-β，其部分免疫抑制功能是通过这些分子发挥作用的，并且转导Foxp3能使它们呈现高表达[12]。本研究通过对初发未治疗HCC患者外周血单个核细胞（PBMCs）中Foxp3和血清AFP水平的检测，分析HCC患者与健康人Foxp3水平的差异，并分析其与血清AFP水平的相关性，以评估其对HCC发生的早期预测价值。

1　资料与方法

1.1临床资料收集60例原发性肝癌患者，均为初发未诊治患者，来源于2013年1月至2014年10月我科住院患者，男52例，女8例；平均年龄47（27～78）岁。诊断符合2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的肝癌临床诊断标准：1.AFP≥400μg/L，影像学检查有肝癌特征的占位性病变者，排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌；2.AFP＜400μg/L，排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并有两种影像学检查符合肝癌特征的占位性病变或有两种肝癌标志物（DCP、GGTⅡ、AFU和CA19-9等）阳性及一种影像学检查有肝癌特征的占位性病变者；3.有肝癌的临床表现并有肯定的肝外转移病灶，排除转移性肝癌者。所有肝癌患者均为乙型肝炎病毒表面抗原阳性，抗HCV阴性，排除患有肝外原发肿瘤者。同时选择健康人20例作为对照，男14例，女6例；平均年龄45（20～75）岁。

1.2血清AFP和HBV DNA检测采用ELISA法,试剂来源于罗氏公司；采用PCR法检测HBV DNA（湖南圣湘生物科技有限公司）。

1.3影像学检查常规进行CT（256排，西门子公司）或MRI（3.0 T,西门子公司）。

1.4 PBMCs Foxp3检测淋巴细胞分离液购于天津市GBD公司；RT试剂盒、PCR试剂盒、DNA Marker均购于美国Fermetas公司；引物由天津金斯瑞公司合成；PCR仪由德国EPPENDORF公司提供；电泳仪、凝胶成像分析系统由美国BIORAD公司提供。抽取外周静脉血3～4 ml，用密度梯度离心法分离PBMCs，提取总RNA，-20℃保存。根据GeneBank检索的基因序列，利用Premier 5软件分别设计FOXP3和β-actin引物（内部参照系统），见表1。以提取的总RNA 5μL为模板，合成cDNA，以cDNA为模板扩增Foxp3基因片段。采用同管扩增法，反应步骤：每管先加入目的基因上下游引物各1μL，加入内参β-actin上下游引物各0.1μmol（1μl），反应体系为30μl，进行30个循环，PCR反应条件为：94℃，2 min（启动）；94℃，30 sec（变性）；57℃，30 sec（退火）；72℃，45 sec（延伸）；再从变性开始循环共30次。72℃，最后，延伸5 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中拍照分析。

1.5统计学分析应用SPSS 19.0统计软件分析。计量资料以（x±s）表示，两组间均数的比较采用两样本t检验。检测水准为α=0.05，采用双侧检验。

2　结果

2.1 HCC患者和健康对照人群PBMCs Foxp3 mRNA水平情况HCC患者和健康人PBMCs FoxP3水平分别为（0.976±0.073）和（0.772±0.083），差异显著（因方差不齐，采用One-Way ANOVA Welch法校正，F＝37.749，P<0.001，图1、图2）。

2.2 HCC患者PBMCs Foxp3 mRNA水平与血清AFP水平的相关性分析经Pearson相关性分析发现，HCC患者FOXP3 mRNA水平与AFP水平呈显著正相关（r＝0.226，P＝0.025，图3）。

3　讨论

Trges在肿瘤的免疫耐受及免疫应答受抑制方面起着关键的作用[13，14]。Tregs细胞介导的潜在的抑制作用阻止了有效的免疫应答，而这些免疫应答对肿瘤的清除及炎症的控制是很关键的[15]。而且，Tregs细胞的消除或功能的抑制能增强抗肿瘤应答[16～19]。越来越多的证据表明Tregs细胞的增加与恶性肿瘤患者病情进展相关[20～23]。目前，研究表明肿瘤患者外周血循环中Tregs细胞计数增加[24～26]。在胃癌、肺癌、胰腺癌和乳腺癌患者外周血均检测出Tregs细胞数增加[27]。动物实验中亦有相应的发现。有研究显示在患恶性肿瘤的大鼠，随着Tregs细胞的减少，其抗肿瘤免疫随之增强[16]。另有动物实验研究证实，过继输入CD4+CD25+Treg细胞能防止或治疗小鼠自身免疫性疾病，延长移植物的存活，而CD4+CD25+Tregs细胞的缺失能诱导自身免疫性疾病，增强抗肿瘤免疫[28]。基于小鼠实验模型的研究揭示清除Treg细胞后，CD4+T细胞和CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫应答明显增强；清除Treg细胞和CD8+T细胞后，CD4+T细胞也能通过IFN-γ依赖机制排斥肿瘤细胞，恢复Treg细胞后，抗肿瘤免疫应答立即被抑制[29]。这些足以说明Treg细胞和肿瘤的发生有直接的关系。Treg可能通过抑制肿瘤抗原的表达或淋巴细胞对肿瘤抗原的免疫应答，导致肿瘤的免疫耐受[29]。

近年，国内外报道Treg细胞对肝癌患者的疾病进展也起到了至关重要的作用[30]，可能因为调节性T细胞可以抑制肝癌患者外周血和肝脏CD4+和CD8+T细胞免疫反应，从而可能促进了肿瘤的进展。有相关研究报道Treg细胞可以抑制CD8+T细胞的增殖以及细胞因子的分泌和穿孔素表达，从而抑制效应细胞对肿瘤的杀伤作用。Ormandy et al研究发现HCC患者外周血Tregs细胞明显增加。有学者对肝癌患者进行临床多因素研究发现调节性T细胞比例增高是肝癌患者预后差的独立危险因素。Gao et al研究表明HCC组织Tregs细胞数量与肿瘤大小及血管侵润相关。Yang J et al研究发现不仅外周血及肝癌组织中Foxp3 Tregs细胞明显增加，而且Tregs细胞的数量与血清AFP水平呈正相关。Sasaki et al研究亦发现Tregs与AFP间存在相关性。

Tregs细胞是CD4+T细胞的一个独特细胞群，而Foxp3是它的关键转录因子。Treg细胞常用的分子标记有CD4+CD25+Tregs、Foxp3、CD127等。Foxp3被称为叉状头（或）翅膀状螺旋转录因子，在T细胞上特异性表达，并且是Treg细胞发育和功能所必需的，可反映Treg的水平和功能活性，目前被作为证实Treg细胞存在的金标准。通过对小鼠肿瘤模型的研究证实，肿瘤部位大量Treg细胞积聚的一个重要机制就是CD4+CD25-Treg向CD25+细胞的转变，并且转化后的细胞表达FoxP3，从而具有抑制活性。因此，通过检测PBMCs中Foxp3 mRNA水平能较好地反映Tregs细胞的水平，且方法学上更简单易行。我们设计这项实验的目的是检测HCC初发现未治疗患者PBMCs中Foxp3 mRNA水平，同时检测患者血清AFP水平，最后对两组数据进行统计学分析，以期发现它们之间的相关性。本研究发现，HCC患者FoxP3水平明显高于健康对照组，它们之间有显著统计学差异。同时发现，HCC患者Foxp3 mRNA水平与AFP水平呈显著正相关，推测检测患者外周血单个核细胞Foxp3 mRNA水平对肿瘤的发生具有一定的预测作用，但Foxp3 mRNA水平升高需持续多长时间，且需达到什么水平才能对HCC发生具预测作用，尚需更大规模的临床试验来进一步证实。

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（收稿：2015-02-28）

（本文编辑：陈从新）

·原发性肝癌·

Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatocellular carcinoma

Yang

Zhi，Chen Hongtao，Wu Shipin. Department of Infectious Disease，People's Hospital，Second Clinical Medical College Affiliated to Jinan University，Shenzhen 518020，Guangdong Province，China

【Abstract】Objective To investigate Foxp3 mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in patients with hepatocellular carcinoma（HCC）and explore its relationship with serum AFP levels. Methods 60 patients with HCC and 20 healthy persons were enrolled in this study. The Foxp3 mRNA in PBMCs was measured by RT-PCR and serum AFP was detected at the same time. Results There existed statistically significant difference in Foxp3 levels between patients with HCC and controls [（0.976±0.073）vs.（0.772±0.083），P<0.01]；Pearson correlation analysis showed positive correlation between Foxp3 levels in PBMCs and serum AFP levels in HCC patients（r＝0.226，P＝0.025）. Conclusion The Foxp3 levels in PBMCs in patients with HCC increase，which might help predict HCC development.

【Key words】Hepatocellular carcinoma；Foxp3；Peripheral blood mononuclear cells；Alpha fetal protein

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.016

通讯作者：吴诗品，E-mail:wupoem@126.com

*基金项目：广东省科技厅青年自然科学基金资助项目（编号：D2011283）