扶正化瘀方对非酒精性肝纤维化小鼠肝组织血管生成基因的调节作用及其对肝纤维化的影响*

谭普芳，南月敏，王荣琦，赵素贤，杜静华，牛学敏

扶正化瘀方对非酒精性肝纤维化小鼠肝组织血管生成基因的调节作用及其对肝纤维化的影响*

谭普芳，南月敏，王荣琦，赵素贤，杜静华，牛学敏

作者单位：050051石家庄市河北医科大学第三医院中西医结合肝病科

第一作者：谭普芳，女，26岁，硕士研究生。主要从事慢性肝病的诊治研究。E-mail：tanpufang@hotmail.com

【摘要】目的探讨血管生成基因在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用，以阐明扶正化瘀方治疗非酒精性脂肪性肝纤维化的作用机制。方法选用7~8w龄健康雄性C57BL/6J小鼠，给予高脂、蛋氨酸-胆碱缺乏（MCD）饮食喂养8w，建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型。采用扶正化瘀方进行干预，以蛋氨酸-胆碱充足饮食设立对照组。以HE和Masson染色观察小鼠肝组织脂肪变、炎症和纤维化程度；采用RT-PCR、免疫组化和Western blot法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及其下游因子血管内皮生成因子（VEGF)和诱导型一氧化氮合酶（iNOs）mRNA及其蛋白水平。结果模型组小鼠肝细胞出现大泡性为主的脂肪变性，小叶内可见点灶状肝细胞坏死及炎细胞浸润、窦周纤维化，汇管区纤维组织增生，纤维间隔形成；应用扶正化瘀方干预组动物肝损伤、炎症及纤维化程度显著改善，肝组织α-SMA、HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA水平亦较模型组显著减低，依次为（3.83±0.53）对（8.33±2.32）、（3.02±0.55）对（4.50±0.78）、（3.23±0.94）对（7.40±1.54）和（3.60±0.96）对（9.94±1.60），（P<0.01）；上述蛋白表达水平与基因水平呈一致变化趋势，扶正化瘀方干预组与模型组α-SMA、HIF-1α、VEGF和iNOs表达水平依次为（0.53±0.04）对（1.08±0.20）、（0.44±0.02）对（0.55±0.08）、（0.54±0.07）对（1.08±0.03）、和（1.61±0.21）对（3.30±0.88），（P<0.05）。结论扶正化瘀方可通过抑制肝星状细胞活化，下调HIF-1α及其下游促血管生成因子VEGF和iNOs表达，阻止或减缓非酒精性脂肪性肝纤维化的进展。

【关键词】肝纤维化；非酒精性脂肪性肝纤维化；扶正化瘀；缺氧诱导因子-1α；小鼠

我们的前期研究表明，扶正化瘀方（Fuzheng Huayu recipe，FZHY）可调节肝脏脂质代谢、调节炎症和与纤维化相关的基因表达，阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的进展[1~3]。我们以高脂、蛋氨酸-胆碱缺乏（Methionine-choline deficient，MCD）饮食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型，应用扶正化瘀方进行治疗研究，为非酒精性脂肪性肝纤维化的中西医结合诊治提供理论依据。

1　资料与方法

1.1实验动物及试剂清洁级7~8w龄健康雄性C57BL/6J小鼠18只，体质量18~22g，购于中国医学科学院实验动物研究所。蛋氨酸-胆碱充足及MCD饲料均购于美国ICN生物医学化学药品公司；扶正化瘀方参照上海黄海制药有限责任公司扶正化瘀胶囊组方制备。鼠抗鼠α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和兔抗鼠β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，兔抗鼠缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和血管内皮生成因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）多克隆抗体购于美国Proteintech公司，兔抗鼠诱导型一氧化氮合成酶（Inducible NO synthase，iNOs）多克隆抗体购于美国Novus Biologicals公司，山羊抗兔/鼠多克隆二抗购于美国Proteintech公司。

1.2非酒精性脂肪性肝纤维化模型的制备将18只小鼠随机分为3组，每组6只。对照组（Control）：给予蛋氨酸-胆碱充足饲料喂养；模型组（MCD）：给予MCD饲料喂养；扶正化瘀方组（MCD+FZHY）：给予MCD饲料加扶正化瘀方15g·kg-1·d-1喂养。喂养8w后，各组小鼠禁食12h。在深度麻醉下，剖腹取肝脏，切取组织两块，浸泡于4%甲醛溶液，备行病理切片检查，其余肝组织用液氮速冻后置于-80℃冰箱保存，备提取蛋白及RNA。

1.3肝组织病理学检查参照2010年修订的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[4]及美国非酒精性脂肪性肝炎（NASH）临床研究协会病理工作组制定的NAFLD组织学评分（NAFLD activity score，NAS）系统[5]对肝组织病理改变进行评分。

1.4肝组织α-SMA、HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA水平检测采用实时定量RT-PCR法，以Trizol法提取RNA，应用Rever Aid First cDNA Synthesis Kit逆转录合成cDNA，以适量cDNA为模板，以GAPDH为内参照，进行实时定量扩增。每个基因重复操作3次，运用2-△△CT法分析结果。依据Genbank设计引物序列，由上海生物工程公司合成，见表1。

1.5肝组织α-SMA蛋白表达检测采用免疫组织化学法，随机选取每张切片10个（200×）视野测定α-SMA表达面积百分比。

1.6肝组织HIF-1α、VEGF和iNOs蛋白表达检测采用Western blot法，应用Quantity one分析系统软件分析电泳条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.7统计学处理应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Student-Newman-Keuls q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肝组织病理学表现模型组肝细胞呈大泡性为主的大、小泡混合性脂肪变，小叶内可见点、灶状肝细胞坏死及炎性细胞浸润，窦周和汇管区纤维组织增生，纤维间隔形成（NAS评分为5~6分，肝纤维化评分为2~3期）；扶正化瘀方处理组动物肝细胞脂肪变、炎性改变和肝纤维化程度均较模型组明显减轻（NAS评分为2~4分，肝纤维化评分为1~2期（图1）。

2.2肝组织α-SMA变化实时定量RT-PCR检测结果显示，与正常对照组比，模型组小鼠肝组织α-SMA mRNA水平显著上调（P<0.001），扶正化瘀方处理组肝组织α-SMA mRNA水平明显降低（P<0.001，图2A）；免疫组织化学检测结果显示，对照组肝组织α-SMA少量表达于汇管区小叶间动脉、小叶间静脉和中央静脉血管壁及胆管壁平滑肌，模型组及扶正化瘀方干预组除上述分布外，主要分布在纤维间隔及肝窦内活化的星状细胞（HSC）胞质中，模型组α-SMA表达量较对照组显著增加（P<0.001），经扶正化瘀方干预后，表达量则明显降低（P<0.001，图2B）。

2.3肝组织HIF-1α、VEGF和iNOs的变化与对照组比，模型组小鼠肝组织HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA和蛋白表达均显著上调（P<0.001），应用扶正化瘀方后HIF-1α、VEGF和iNOs表达较模型组明显降低（P<0.01，图3）。C1分别为HIF-1α、VEGF、iNOs mRNA水平变化，MCD组小鼠肝组织HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA水平较对照组均显著上调，应用扶正化瘀方后HIF-1α、VEGF和iNOs mRNA水平明显降低；A2、B2、C2分别为HIF-1α、VEGF、iNOs蛋白表达变化，MCD组小鼠肝组织HIF-1α、VEGF和iNOs蛋白表达较对照组均显著上调，应用扶正化瘀方小鼠HIF-1α、VEGF和iNOs蛋白表达明显降低。

与对照组比，*P<0.001；与MCD组比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

A1、B1、

3　讨论

HIF-1是缺氧调控信息通路中的关键因子，主要由HIF-1α和HIF-1β亚基组成，其中HIF-1α是主要调节亚基[6，7]。肝组织缺氧诱导HIF-1α表达增加，促进其下游靶基因VEGF和iNOs表达。VEGF是目前已知作用最强的促血管生成因子[8]，而血管生成与肝纤维化形成密切相关[9]。iNOs是一氧化氮合成过程中的关键限速酶，在缺氧等病理状态下表达异常升高。本研究显示，伴随MCD饮食诱导的小鼠肝组织弥漫性脂肪变、炎细胞浸润及纤维组织增生，肝组织α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs mRNA及蛋白表达显著上调，其可能的机制为：①MCD饮食导致肝细胞脂肪变、小叶内坏死性炎症，诱导TGF-β1等炎性细胞因子释放，使HSC活化并表达α-SMA，活化的HSC收缩性增强，使血窦收缩，并促进窦周间隙胶原沉积，引起肝窦内皮细胞去窗孔化及基底膜形成，导致肝窦毛细血管化，肝脏微循环障碍，减弱了肝细胞和血液之间的氧和营养物质交换，使肝组织出现缺氧状态[2]；②缺氧诱导肝组织HIF-1α表达增加，其与下游靶基因VEGF和iNOs缺氧反应元件结合，促进上述因子表达，进一步加速HSC活化及Ⅰ型胶原分泌，导致肝纤维化[10,11]；③VEGF诱导血管生成，进而促进再生肝细胞团周围形成血管丛和分流，肝内血管结构紊乱，使血窦和肝细胞物质交换障碍，进一步加重肝组织缺氧，VEGF也可促进单核细胞黏附于血管内皮细胞，向肝组织浸润[12,13]，并可通过刺激HSC活化、增殖和迁移，增加Ⅰ型胶原表达，促进肝纤维化形成[14]；④iNOs可通过产生具有细胞毒性的NO，引起肝组织损伤及炎症反应，并可诱导VEGF合成，促进血管形成和血管渗透性增加，加速非酒精性脂肪性肝纤维化进展[15,16]。

扶正化瘀方由虫草菌丝、桃仁、丹参、绞股蓝、五味子、松花粉组成。既往研究发现，虫草菌丝可以抑制二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠肝星状细胞活化，增加肝窦血管内皮细胞通透性，改善肝组织缺血缺氧状态[17]；桃仁具有改善血吸虫病肝纤维化肝窦毛细血管化，增加肝脏血流量，促进细胞外基质降解[18,19]；丹参能下调四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1表达，显著抑制HSC活化，明显改善肝纤维化的程度[20]。本研究显示，应用扶正化瘀方小鼠伴随α-SMA、HIF-1α、VEGF、iNOs mRNA和蛋白表达的抑制，肝组织脂肪变、炎症及纤维化程度明显减轻，提示扶正化瘀方可能通过阻止HSC的活化及增殖，抑制肝窦毛细血管化，改善肝脏微循环及肝组织缺氧状态，进而抑制HIF-1α及其下游基因表达；亦可能通过抑制Kupffer细胞及HSC表达VEGF，阻止新生血管形成，促进肝窦毛细血管化的逆转，或可通过抑制iNOs表达，减轻氧化应激反应及肝细胞损伤，从而阻止肝脏炎症及肝纤维化的发生和进展。此外，TGF-β1是诱导HSC活化的主要细胞因子[21]。我们前期研究发现，扶正化瘀方可下调肝脏TGF-β1表达[1]，提示该方可抑制TGF-β1激活HSC的作用，使HIF-1α及其下游血管生成基因表达减少，进而阻止肝纤维化的发生和发展。

我们的研究结果表明，血管生成基因参与MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝纤维化的形成，扶正化瘀方可通过抑制HSC活化，改善肝脏微循环，下调HIF-1α及其下游因子VEGF和iNOs表达，阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的发生和进展，为传统中药扶正化瘀方在临床用于非酒精性脂肪性肝纤维化的治疗提供了理论依据。

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（收稿：2015-03-07）

（本文编辑：陈从新）

·病毒性肝炎·

Impact of Fuzheng Huayu recipe on the expression of angiogenic growth factor in mice with nonalco-

holic fatty liver diseases

Tan Pufang，Nan Yuemin，Wang Rongqi，et al. Division of Liver Diseases，Department of

Integrated Traditional and Western Medicine，Third Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，Hebei Province，China

【Abstract】Objective To investigate the role of the angiogenic gene in the development of nonalcoholic fatty liver diseases（NAFLD）and to elucidate the mechanism of Fuzheng Huayu（FZHY）recipe in alleviating NAFLD related fibrosis in vivo. Methods Healthy male C57BL/6J mice aged 7~8 weeks were adopted to induce NAFLD related fibrosis by feeding methionine-choline deficient（MCD）diet for 8 weeks. Meanwhile，the intervention group was administrated with FZHY. Histological hepatic change in mice such as hepatic steatosis，inflammation and fibrosis were observed by hematoxylin & eosin and Masson trichrome staining. The expression of α-smooth muscle actin（α-SMA），hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）and its downstream factors e.g. vascular endothelial growth factor（VEGF）and inducible nitrogen synthase（iNOs）were detected by either quantitative real-time PCR or Western blot or immunohistochemistry. Results The mice in model group were present with macrovesicular steatosis，inflammatory infiltration and spotty and focal necrosis in hepatic lobule，peri-sinusoid fibrosis，and proliferation of fibrous tissues and fibrous septums in portal area，while the hepatic damage，inflammation and fibrosis in the intervention group were ameliorated by FZHY administration；Meanwhile，significantly down-regulated mRNA levels of α-SMA，HIF-1α，VEGF and iNOs in the intervention group were observed [（3.83± 0.53）vs.（8.33±2.32），（3.02±0.55）vs.（4.50±0.78），（3.23±0.94）vs.（7.40±1.54），（3.60±0.96）vs.（9.94±1.60），respectively，（P<0.01）for all]，and the protein expression were consistent with their mRNA，e.g. [（0.53± 0.04）vs.（1.08±0.20），（0.44±0.02）vs.（0.55±0.08），（0.54±0.07）vs.（1.08±0.03），（1.61±0.21）vs.（3.30± 0.88），respectively，P <0.05]. Conclusion FZHY recipe down-regulates the expression of HIF-1α and its downstream pro-angiogenic growth factors，VEGF and iNOs，by inhibiting the activation of hepatic stel－book=353,ebook=250late cells（HSCs），thus preventing or retarding the development of NAFLD related fibrosis in mice.

【Key words】Hepatic fibrosis；Nonalcoholic fatty liver diseases；Traditional Chinese hebal medicine；Hypoxiainducible factor-1α；Mice

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.04.005

通讯作者：南月敏，E-mail：nanyuemin@163.com

*基金项目：河北省自然科学基金资助项目（编号：H2013206276）；河北省中医药管理局科研基金项目（编号：2013015）；百洋肝纤维化研究基金（编号：001）