会泽县仔猪黄白痢大肠杆菌的分离与鉴定及耐药性实验

张世永严玉霖王文梅吕忠芬

(1.会泽县宝云街道畜牧兽医站,云南曲靖654200;2.云南省农业大学,云南昆明650201; 3.会泽县娜姑镇畜牧兽医站,云南曲靖654200; 4.会泽县畜牧局技术服务中心,云南曲靖654200)

会泽县仔猪黄白痢大肠杆菌的分离与鉴定及耐药性实验

张世永1严玉霖2王文梅3吕忠芬4

(1.会泽县宝云街道畜牧兽医站,云南曲靖654200;2.云南省农业大学,云南昆明650201; 3.会泽县娜姑镇畜牧兽医站,云南曲靖654200; 4.会泽县畜牧局技术服务中心,云南曲靖654200)

分析会泽当地仔猪大肠杆菌对抗菌药物的敏感度,为临床中大肠杆菌病的防治提供理论依据;了解会泽县仔猪黄白痢大肠杆菌是否存在及其流行情况;为深入研究仔猪大肠杆菌的耐药机制及其致病机制奠定物质基础。会泽县关于仔猪大肠杆菌病流行情况,目前未见有相关报道,本研究的开展能为会泽县动物性大肠杆菌病的研究提供相关资料。

大肠杆菌;致病性;血清型;耐药性;超广谱β-内酰胺酶

1 会泽县仔猪黄白痢流行情况

目前，会泽县境内21个乡（镇）大部分规模化生猪养殖场及散养户均不同程度存在仔猪黄白痢的流行，但规模化猪场由于对猪只的饲养管理更加合理化，致使其发病率相对较低。经本人调查，使用仔猪黄白痢相关疫苗进行免疫的猪场，仔猪黄白痢的发生几率较低，同时即便有少量猪只发病使用常规的抗生素类药品均能有较好疗效；不使用疫苗的猪场一旦发病，在使用抗生素时往往疗效较差或需要使用大量药物才能控制疫病的发展。

在疫苗使用方面大部分规模化养殖场均选用三价基因工程苗；在药物选择方面则主要包括口服类（氟苯尼考、恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素、氧氟沙星、强力霉素、阿莫西林、盐酸洛氟沙星及某些中药或中成药等）、注射类（磺胺苄甲氧嘧啶）及外用类（氯氟平）。

2 采样方法

依据仔猪黄白痢的临床特征，选择10日龄内表现精神沉郁，腹泻，排出淡黄色、乳白色或灰绿色糊状粪便的仔猪，以窝为单位采集粪便，编号后作为试验原料。

3 试验方法

3.1 会泽县仔猪黄白痢大肠杆菌的分离

采集会泽县部分规模化养殖场及散养户疑似仔猪黄白痢粪便，从单份粪便中挑取约0.5g样品用10ml灭菌生理盐水稀释后，离心机内离心取上清液约0.5g，以灭菌棉签捈布于麦康凯培养基，置温箱内培养37℃24h后；挑选单个粉红菌落再次分别接种于麦康凯培养基及伊红美蓝培养基，置温箱内培养37℃24h后，观察记录并保存结果。

3.2 形态学鉴定

将上述分离培养所得菌株，以革兰氏染色法染色后，在显微镜下观察并记录结果。

3.3 生化鉴定

将经纯化培养后菌种接种到葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、尿素、硫化氢、明胶、蔗糖、v-p及蛋白胨微量试剂管中，置37℃24h后，观察并记录结果；

3.4 菌株的保存

将所需保存菌株的肉汤培养物取适量置于密闭试管内，加入终浓度为30%的甘油生理盐水，置-20℃冰箱保存，保存半年后重新转种。

4 结果

由相关结果得出，大肠杆菌在麦康凯培养基上呈微红色菌落，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

由相关结果得出，大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上呈深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。

本次试验共采集到疑似仔猪黄白痢粪便40份，分离培养得到疑似大肠杆菌（在麦康凯琼脂平板上呈微红色菌落，在伊红美蓝琼脂平板上呈黑色带金属光泽菌落）共35份。

5 讨论

5.1 细菌分离培养

在2012年7月至2013年5月期间，从会泽县内8个猪场共采集到特征性仔猪黄白痢粪便样本40份，仔猪品种包括苏太、洋三元、PIC、约长撒、杜约共5个品种，利用麦康凯和伊红美蓝培养基进行鉴别培养，共分离到疑似大肠杆菌菌株35份，这说明从具备仔猪大肠杆菌病典型临床表现的病仔猪粪便中能分离培养到的菌种可能有很多种，临床上如需确认仔猪病原类型，必须采样后送相关实验室进行检测。

5.2 形态学及生化鉴定

此次所分离的40份菌株，经革兰氏染色镜检后的35份菌株，生化鉴定与形态鉴定结果表现一致，分离率为87.5%。

5.3 具有较强的致病性

4株产ESBLS菌株，对小白鼠的致病率均为100%，但在相同浓度条件下，同菌株不同个体小白鼠的死亡时间不同，不同菌株不同个体小白鼠的死亡时间也不同。并且由于4份菌株中有1株无血清型鉴定结果作为参考依据，故实际的致病性大肠杆菌的感染率可能更高。

国内外近几年的研究调查发现能致病的大肠杆菌血清型越来越多，在防治本病的过程中应充分考虑疫苗及药品的选择，以达到最好的免疫及治疗效果。

5.4 对常用药物具有广泛耐受性

此次分离培养的菌株对除头孢噻肟（耐药率17.5%）、头孢他啶（耐药率2.5%）及多粘菌素（耐药率2.5%）外的其他强力霉素等7种常用药物（耐药率均＞50%）有广泛的耐受性，其中氨苄西林和阿莫西林的耐药率甚至＞80%，这可能和本地区临床过多使用这两类药物有关。此外此次测定的40份菌株中，单一菌株对抗生素耐受性表现为最少的耐受2种药品，最多的耐受7种药品，并且耐受药物的种类有的相同有的不同，这可能和本猪场使用药品的种类及菌株自身血清型有关。

抗菌药不仅能预防和治疗动物疾病，有些甚至还能起到很好的促生长作用，这使得养殖业的持续发展离不开抗菌药物。因此，长期使用抗菌素和滥用抗生素是药物残留及细菌耐药性产生的源头，两者相互依赖而存在，使细菌耐药性的危害越来越严重。

因此建议，应每年定期对菌株进行抗生素敏感性监测，在选择药物时不能仅仅依靠经验，而应根据药敏试验结果选择最有效的药物控制大肠杆菌病。在临床上应停用已普遍产生耐药性或已明显无效的药物，选用目前应用较少、经药敏试验证明对大肠杆菌敏感的药物。

6 结论

（1）会泽县存在仔猪黄白痢耐药性大肠杆菌，其中少数耐药性菌株甚至能产生ESBLS。

（2）产ESBLS菌株SHV和CTX-M基因检测呈阳性。

（3）产ESBLS菌株具有较强的致病性。

（4）从本实验可看出，目前楚雄州存在的致病性大肠杆菌除对头孢噻肟、头孢他啶及多粘菌素外的其他7种常抗生素即：强力霉素（四环素类）、庆大霉素（氨基糖苷类）、阿莫西林（青霉素类）、环丙沙星（喹诺酮类）、氧氟沙星（喹诺酮类）、氨苄西林（青霉素类）、青霉素G（青霉素类）均表现不同程度耐药性。

[1]顾欣，金凌艳，蔡金华，等.国家动物源细菌耐药性监测工作的探讨和建议[J].中国兽药杂志，2009，（7）：45-50.

[2]张秀英，芦秀梅.大肠杆菌对兽医临床抗菌药物耐药性情况分析[J].中国兽药杂志，2003，37（3）：33-50.