缺氧/复氧条件下体外培养星形胶质细胞神经生长因子分泌的变化

2015-04-03 06:55肖君张函谢敏杰王伟何丹
神经损伤与功能重建 2015年1期

肖君,张函,谢敏杰,王伟,何丹

缺氧/复氧条件下体外培养星形胶质细胞神经生长因子分泌的变化

肖君,张函,谢敏杰,王伟,何丹

目的:观察缺氧/复氧(H/R)条件下体外培养星形胶质细胞的活力变化及神经营养因子(NGF)的合成和分泌的变化。方法:采用原代培养的新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞,分为正常(N)组及H/R组。在H/R不同时间点,应用倒置显微镜进行形态学观察,并结合台盼蓝染色,明确缺氧不同时间对星形胶质细胞形态和活力的影响。在H/R不同时间后,应用ELISA检测星形胶质细胞培养上清液中NGF蛋白的含量,应用qRT-PCR检测NGF mRNA的表达。结果:缺氧6 h、复氧48 h内,H/R组的星形胶质细胞的细胞活力未发生明显改变。在缺氧6 h、复氧12 h以及24 h后,H/R组的NGF mRNA表达量及蛋白的分泌较N组显著增加(<0.01)。结论:H/R条件可促进体外培养星形胶质细胞NGF的分泌及合成量的增加。

星形胶质细胞;神经生长因子;缺氧/复氧

脑缺血再灌注损伤是很多神经系统疾病如脑卒中、颅脑损伤等共同的病理过程,其发生与发展会导致神经细胞死亡,引起脑水肿、脑疝甚至脑死亡等严重后果,导致患者的预后不良[1,2]。目前仍未阐明其确定机制,以及发现有确切疗效的脑保护剂[3]。因此,抑制脑缺血再灌注损伤并研发靶向神经保护干预策略,一直是神经科学领域研究的热点。

神经营养因子家族(neurotrophic factors,NTFs)是一类分泌蛋白,具有调控神经细胞存活和功能维持的作用,包括神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源 性神经 营养因 子(brain-derived neurotrophic factor,BNDF)、神经胶质细胞源性的神经营养因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor,GNDF)等,每一种都在神经损伤恢复过程中有重要作用[4,5]。NGF是最早发现的神经营养因子,是Levi-Montalcini在1951年首次发现的[6],它可以抑制神经细胞的凋亡,减少神经变性,具有刺激轴突再生以及促进神经细胞存活、生长及分化的作用[7]。多项研究表明,在脑缺血时,星形胶质细胞活化,NGF表达量升高,对神经元的存活起重要的保护作用[8-10]。本研究通过建立体外培养星形胶质细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,观察脑H/R对星形胶质细胞NGF合成以及释放的影响,探讨脑缺血时NGF分泌及表达对神经损伤修复的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新生2 d以内的SD大鼠乳鼠40只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂与材料 DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(购自美国Hyclone公司);4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-pheny lindole,DAPI)、台盼蓝及多聚赖氨酸(购自美国Sigma公司);兔抗多克隆GFAP抗体(购自美国Neomarkers公司);NGF ELISA试剂盒(购自美国Millipore公司);RT-PCR试剂盒(购自美国Ferments公司);兔抗NGF多克隆抗体及羊抗兔HRP二抗(购自英国Abcam公司);GAPDH兔抗单克隆抗体(购自美国Santa Cruz Biotechnology公司);CY3标记驴抗兔IgG(购自美国Jackson公司)。

1.2 方法

1.2.1 星形胶质细胞原代培养及鉴定 参考Kliot等[11]的方法,无菌条件下取新生大鼠的大脑皮质,眼科剪剪碎后,经直径200目的筛网过滤,800 rpm离心8m in,去除上清,加入全培养基(DMEM/F12+20%胎牛血清)重悬,接种到多聚赖氨酸(0.1mg/mL)包被过的培养瓶,置于37℃、95%O2、5%CO2培养箱中培养;每隔2~3 d换液一次。细胞生长至融合时按1∶(2~3)传代至新培养瓶培养。培养的星形胶质细胞按照形态特点和免疫荧光染色进行鉴定。实验所用细胞为传2代细胞。通过GFAP免疫荧光染色对细胞进行鉴定。处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化后接种至12孔板中,无水甲醇固定15 m in,0.2%Triton-PBS液中破膜15m in,10%BSA-PBS封闭2 h,多克隆兔抗GFAP(1∶200)4℃过夜,Cy3标记驴抗兔IgG(1∶200)室温下孵育1 h。细胞核用DAPI标记(室温下5m in)。每个观察点随机取3个200倍视野进行观察计算,计数绿色荧光细胞占所有细胞(蓝色荧光)的比例。

1.2.2 H/R模型建立及实验分组 H/R模型建立:采用缺氧孵箱法,将含5%CO2正常培养箱中的星形胶质细胞置于94% N2、1%O2及5%CO2的缺氧培养箱培养环境中缺氧不同时间点(3、6、12 h),再复置于含5%CO2正常培养箱复氧培养相应时间点(0、12、24、48、72 h),进行后续实验。将体外原代培养星形胶质细胞分为2组:正常(normal,N)组及H/R组。

1.2.3 评估H/R对细胞活力的影响 分别通过星形胶质细胞形态学观察及台盼蓝染色法对细胞活力进行评估。星形胶质细胞形态学观察:将细胞培养皿置于倒置显微镜下观察细胞的形态及贴壁与生长情况,研究缺氧不同时间点(3、6、12 h)星形胶质细胞形态的改变。台盼蓝染色法于H/R不同时间点(0、12、24、48、72 h)测定细胞死亡率,从而判断星形胶质细胞的活力。具体步骤按照Patterson[12]的方法进行,每个时间点取3孔,0.4%台盼蓝溶液染色,3m in内随机计数200个相邻细胞中蓝染细胞(死亡细胞)和未蓝染细胞(存活细胞)个数,计算细胞死亡百分比,结果以%表示。

1.2.4 ELISA检测培养上清NGF蛋白浓度 按照ELISA试剂盒的操作说明书步骤,每个样本取细胞培养上清液100μL,检测各组培养上清中NGF蛋白的浓度。

1.2.5 qRT-PCR检测NGFm RNA的表达用Trizol法提取细胞总RNA,按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。按照SYBR Green Mix 10μL、上下游引物各1μL、cDNA1μL、ddH2O 7μL配制 20μL的real-time PCR体系,在ABI7 100 real time PCR仪上进行反应。各引物设计如下:NGF(上游:5'-TGGACCCAAGCTCACCTCA-3',下游:5'-GTGGATGAGCGCTTGCTCCT-3'),β-actin(上游:5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3',下游:5'-CAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3')。读取各组CT值,用ΔΔCT法计算相对表达量差异。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件分析数据,计量结果以(均数±标准差)表示,单因素方差分析(one-way ANOVA),<0.05为差异有统计学意义。

表1 2组复氧不同时间点星形胶质细胞死亡比较[个(%),±s]

注:与N组比较,①<0.01

组别 0 h 12 h 24 h 48 h 72 h N组 2.33±1.53 (1.17±0.76)3.33±1.53 (1.67±0.76)5.33±0.58 (2.67±0.29)7.67±0.58 (3.83±0.29)11.33±1.53 (5.67±0.76)H/R组 2.12±0.16 (1.06±0.08)3.66±1.68 (1.83±0.84)5.67±1.53 (2.83±0.76)8.33±0.58 (4.17±0.29)19.33±3.06 (9.67±1.53)①

2 结果

2.1 体外培养星形胶质细胞的形态学观察与鉴定

显微镜下可见分离的原代培养皮质星形胶质细胞种植后分散均匀,1 d后基本贴壁,细胞呈梭形或圆形,细胞体小,折光性高;在培养第5~7天分化成熟,形成密集的细胞网络,细胞体变大,呈放射多分支状,折光性低。经原代培养传2代时用GFAP和DAPI双标免疫荧光染色鉴定其纯度,(97.96±3.76)%的细胞为星形胶质细胞,符合实验要求,见图1。

2.2 H/R不同时间点星形胶质细胞活力的变化

在缺氧干预3、6、12 h进行观察,镜下可见随着缺氧时间的延长,星形胶质细胞的细胞体皱缩,折光性减低,细胞贴壁不牢,出现细胞碎片增多。缺氧6 h内,H/R组细胞较N组形态学变化尚不明显,缺氧12 h时H/R组星形胶质细胞出现大量空泡,细胞破碎甚至死亡,视野中几乎见不到形态完整的细胞,见图2。因此,本实验选择缺氧6 h作为后续的干预时间,以排除细胞死亡对实验结果的影响。

台盼蓝染色鉴定缺氧6 h复氧不同时间点的细胞死亡率显示,随着复氧时间的延长,蓝染细胞的数目逐渐增多,见表1。复氧48 h内,H/R组星形胶质细胞的死亡率较N组差异无统计学意义(>0.05),复氧72 h时,细胞死亡率明显高于N组(<0.01)。这表明,与N组比较,H/R组缺氧后复氧48 h内不会引起显著的细胞死亡,为了排除细胞死亡对实验结果的影响,后续实验的检测时间控制在复氧48 h内。

2.3 H/R后2组星形胶质细胞分泌NGF的变化

与N组相比,H/R组细胞培养液中的NGF蛋白的浓度随着复氧时间的增加而增高,在缺氧6 h、复氧0~12 h内差异无统计学意义,在复氧24 h及48 h时NGF浓度分别为N组的1.38倍和1.54倍,有显著性差异(<0.01),见图3A、表2,这表明H/R损伤可刺激体外培养星形胶质细胞NGF蛋白的分泌增加。

2.4 H/R后2组星形胶质细胞NGF mRNA的表达变化

表2 复氧不同时间点2组星形胶质细胞分泌NGF蛋白比较(pg/mL,±s)

注:与N组比较,①<0.01

组别 0 h 12 h 24 h 48 h N组 96.21±7.16 102.30±6.88 104.40±5.11 105.60±6.51 H/R组 100.82±3.69 112.10±1.25 144.10±8.70① 162.60±6.24①

缺氧6 h、复氧不同时间点,N组的星形胶质细胞有一定量的NGF mRNA的表达,其表达量较恒定;与N组相比,H/R组的NGF mRNA在缺氧6 h、复氧0~12 h内表达量轻度增加,差异无统计学意义(>0.05);在复氧12 h、24 h和48 h时表达量明显增加(<0.01),与ELISA检测结果基本一致,见图3B、表3。

3 讨论

星形胶质细胞作为大脑中含量最丰富的细胞类型,能够对神经元提供代谢和营养支持,调控突触可塑性,生理情况下通过合成和释放神经营养因子(如NGF)来支持神经元,维持大脑功能的稳定[13]。在许多神经系统疾病,如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等,星形胶质细胞通过释放NGF发挥神经保护作用[14-17]。众所周知,在脑缺血早期,星形胶质细胞活化 增生,起到促进神经元的修复、轴突生长和神经功能性恢复的作用[7,8]。由此笔者推测,脑缺氧时,星形胶质细胞NGF表达量增加,NGF通过调控神经元的存活和生长,减少神经损伤的发生。

表3 复氧不同时间点2组星形胶质细胞表达NGF mRNA比较(±s)

注:与N组比较,①<0.01

组别 0 h 12 h 24 h 48 h N组 1.00±0.06 1.08±0.15 1.12±0.23 1.09±0.11 H/R组 1.01±0.17 1.34±0.28① 1.50±0.19① 1.64±0.38①

为了验证上述假说,本研究探讨H/R对体外培养星形胶质细胞活力变化及NGF的合成和分泌的影响。本研究首先通过倒置显微镜观察星形胶质细胞缺氧不同时间点的形态改变,从而确定缺氧6 h为干预时间,然后通过台盼蓝染色检测复氧不同时间点下星形胶质细胞细胞死亡率的变化,发现H/R组在单纯缺氧6 h/复氧48 h以内,星形胶质细胞的细胞死亡率较N组并无明显变化,提示在此实验条件下不会引起星形胶质细胞的死亡。本研究进一步通过 ELISA和qRT-PCR法检测复氧不同时间点大鼠皮质星形胶质细胞NGF的蛋白分泌及mRNA的表达水平,结果发现复氧12 h后及24 h后,H/R组NGFm RNA的表达量及蛋白的分泌较N组有显著增加。在体实验中,贾杰等[18]在大鼠脑缺血急性期腹腔注射NGF,观察到MCAO组缺血再灌注损伤程度较对照组明显减轻,也提示NGF对脑缺血再灌注损伤发挥脑保护作用。Chiaretti等[19]进行在体实验发现侧脑室注射NGF可以增加局部脑血流,减少脑梗死体积,并且显著改善脑缺血缺氧损伤后的脑功能。因此,本研究的结果提示星形胶质细胞在H/R时通过增加NGF合成,促进其分泌,发挥脑保护作用,为进一步研究促进神经损伤后修复奠定理论基础。

关于脑缺血损伤时星形胶质细胞NGF的合成及分泌变化,不同学者有不同观点。Isackson等[20]发现,在正常的成年大脑中,NGF主要在神经元上表达,并且对星形胶质细胞NGF的释放起抑制作用;在神经损伤时,星形胶质细胞活化增殖,NGF的表达量明显增高,他们认为星形胶质细胞与神经损伤后NGF表达量的增高有关[9]。而另有研究却发现包括NGF在内的神经营养因子在糖氧剥夺1 h,再灌注24 h的情况下,其表达量下调[21]。结论的不一致可能与实验条件、缺氧模型构建方法不同、缺氧及再灌注的时间不同所导致。脑缺血时星形胶质细胞NGF释放与损伤的程度和时间窗密切相关,具体关系还需进一步研究来阐明。

综上所述,笔者认为,H/R情况下可以诱导体外培养星形胶质细胞NGF的合成和释放的增加,提示星形胶质细胞活化所释放的NGF在脑缺血再灌注情况下可能发挥一定的脑保护作用,其脑保护时间窗和作用机制还有待进一步研究。

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(本文编辑:王晶)

Objective:To investigate the secretion of nerve growth factor(NGF)in primary cultured astrocytes under hypoxia/reoxygenation (H/R).Methods:Primary cultured rats cortical astrocytes were used,which were randomly assigned into groups of normal control(N group)and hypoxia/reoxygenation(H/R group).Morphological observation of the astrocytes was detected by inverted phase contrast microscopy as an index of cellular damage under hypoxia.And tyrpan blue staining was applied to detect the cell injury rate at different time after reoxygenation.The levels of NGF protein were analyzed by enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA).And qRT-PCR was used to determine the levels of NGF mRNA.Results:The astrocytes viability of the H/R group has no significant changed after 6 h hypoxia and 48 h reoxygenation.Compared with the N group,the NGF mRNA level of the H/R group was remarkably increased after 24 h reoxygenation and 6 h hypoxia(<0.01),and the level of NGF protein secretion of the H/R group increased significantly as well after48 h reoxygenation and 6 h hypoxia(<0.01).Conclusion:Hypoxia/reoxygenation effectively increased the expression of NGF in primary cultured astrocytes.

astrocyte;nerve growth factor;hypoxia/reoxygenation

R741;R741.02

A DOI 10.3870/sjsscj.2015.01.001

华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科武汉 430030

国家自然科学基金(No.81301126,810 30021);中国博士后科学基金(No.2013M 53169 9)

2014-07-21

何丹hedan4103@sina.com