蕨菜总黄酮的提取及抗氧化性

陈燕芹　刘红　蔡丽

摘要：为了探明蕨菜中黄酮类物质提取工艺及其抗氧化性，为进一步开发利用蕨菜提供依据。以蕨菜为原料，采用单因素试验和正交试验，研究了超声波提取温度、提取时间、乙醇浓度、料液比等工艺参数对蕨菜总黄酮提取率的影响。结果表明，蕨菜总黄酮的超声提取工艺为：料液比1 g ∶[G-3]45 mL、提取温度70 ℃、提取时间20 min、乙醇浓度80%，该条件下提取率为245%。蕨菜总黄酮的抗氧化性随着浓度的升高而增强，当总黄酮浓度为089 mg/L时，对羟基自由基清除率达到651%；当总黄酮浓度为1115 mg/L时，对DPPH自由基的清除率达到865%。

关键词：蕨菜；黄酮；超声提取；正交试验；提取工艺；抗氧化性

中图分类号： TS2073；R2842文献标志码： A

文章编号：1002-1302（201412-0299-03

野生蕨菜在自然界中广泛分布于荒坡，林缘、稀疏针阔叶和灌木丛中，以未展开的叶柄供食，其味道鲜美，质地脆嫩，营养丰富，清香适口，是广大群众喜食的一种山野菜，被当今国内外营养学家誉为森林蔬菜，是市场的畅销品[1]。蕨菜全株均可入药，有很高的药用价值，有固表止汗、消热解毒、强健脾胃、降气化痰、润肠驱虫的功效，可治疗高血压、头晕失眠、脱肛、痢疾等，虽然人类食用蕨菜的历史悠久，但对其深入研究较少。

黄酮类物质在医学上有很大医用价值，现已成为药学和保健食品学的研究热点，医学界普遍认为黄酮类物质具有抗氧化性，能消除体内过多的自由基，从而在抗衰老、抗肿瘤和糖尿病的治疗方面有较大的医用价值，此外黄酮还具有改善心脑血管循环、降低血清胆固醇、解痉抗过敏等方面的作用。研究结果表明蕨菜黄酮类物质在消除体内过多自由基方面有良好的作用。本试验对蕨菜中总黄酮的超声提取工艺进行研究，并对其抗氧化性进行探讨，以期为蕨菜功能成分的研究开发提供依据。

1材料与方法

11仪器与试剂

电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9070A，上海秼马恒温设备厂产品，电磁式矿石粉碎机（DF-4，杭州卓驰有限公司产品，超纯水机（UPT-II-40L，成都超纯水有限公司产品，电子分析天平（BSA224S，德国赛多利斯公司产品，紫外可见分光光度计（Cary 50，美国瓦里安公司产品。

蕨菜（采自毕节阳山公园；芦丁（国药集团化学试剂有限公司产品，98%；无水乙醇、硫酸亚铁、盐酸、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、水杨酸、双氧水、DPPH等试剂均为国产分析纯。

12方法

121样品制备

蕨菜样品用自来水清洗后，再用超纯水洗涤多次，在80 ℃烘干24 h后，用粉碎机粉碎并过80目筛，置于干燥器中备用。

122芦丁标准曲线绘制

准确称取220 mg芦丁用30%的乙醇配制成022 mg/mL标准溶液，分别准确吸取标准芦丁溶液0、2、4、6、8、10 mL，分别置于25 mL容量瓶中。依次加入5 mL 30%乙醇溶液、1 mL 5% NaNO2溶液，静置5 min后，加1 mL 10% Al（NO33溶液，静置6 min后，加入5 mL 4% NaOH溶液，用30%乙醇溶液定容，静置10 min后，在波长为5091 nm处测出标准系列的吸光度，绘制标准曲线。得标准曲线方程为D=10738 6x+0019 4，线性相关系数为0999 7。

123蕨菜总黄酮含量的测定

准确称取05 g蕨菜粉末于50 mL磨口锥形瓶中，加入一定量乙醇，在一定温度下超声波辅助提取一定时间，趁热减压抽滤，用30%乙醇定容于 50 mL 容量瓶中，作为待测液。然后，取上述溶液5 mL于 25 mL 容量瓶中，加入5% NaNO2 1 mL，摇匀，静置6 min，加入10% Al（NO33 1 mL，摇匀，静置6 min，加入4% NaOH 10 mL，用30%乙醇定容。15 min后在5091 nm处测定吸光度D，以试剂作空白参比。

[J]Y=[SX（]C×25×10m×1 000[SX]×100%。

式中：m为样品质量；C为黄酮溶液浓度；Y为黄酮得率，10为所取溶液的倍数。

124各因素对蕨菜总黄酮提取率的影响

乙醇浓度，在料液比1 g ∶[G-3]45 mL、超声温度60 ℃、超声时间20 min的条件下改变乙醇浓度（60%、70%、75%、80%、90%，确定乙醇浓度对蕨菜总黄酮提取率的影响。

料液比，在乙醇浓度80%、超声温度60 ℃、超声时间20 min的条件下改变料液比（1 ∶[G-3]30、1 ∶[G-3]40、1 ∶[G-3]45、1 ∶[G-3]50、1 ∶[G-3]60，g ∶[G-3]mL，测定料液比对蕨菜总黄酮提取率的影响。

超声温度，在乙醇浓度80%、料液比1 g ∶[G-3]45 mL、超声时间 20 min 条件下改变超声温度（30、40、50、60、65、70 ℃，测定超声温度对蕨菜总黄酮提取率的影响。

超声时间，在乙醇浓度80%、料液比1 g ∶[G-3]45 mL、超声温度 60 ℃ 的条件下改变超声时间（5、8、10、20、30、40 min，测定超声时间对蕨菜总黄酮提取率的影响。

125正交试验优化蕨菜总黄酮提取工艺

在单因素试验的基础上，以蕨菜为材料，以超声波作用时间、料液比、乙醇浓度、温度为主要因素，采用L9（34正交表设计正交试验，以确定蕨菜中总黄酮的最佳提取工艺条件，各因素水平见表1。

126蕨菜总黄酮抗氧化性的测定

[CM（26]1261对·OH的清除率采用水杨酸比色法测定黄酮[CM]

[F（W7][HT6H][J][WTH]表1L9（34正交试验因素水平[HTSS][STB][WTB]endprint

[HJ5][BG（！][BHDFG42，W3，W26W]水平[B（][BHDWG12，W26W]因素

[BHDWG3，W62。4W]A：乙醇浓度（%B：料液比（g ∶[G-3]mLC：时间（minD：温度（℃[BW]

[BHDG12，W3，W62。4W]1751 ∶[G-3]401060

[BHDW]2801 ∶[G-3]452065

3901 ∶[G-3]503070[HJ][BG）F][F）]

对羟基自由基的清除作用。分别取黄酮提取液005、01、02、04、06、08 mL于试管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2 2 mL，摇匀后静置10 min。加入 6 mmol/L 水杨酸2 mL，摇匀后静置30 min，在510 nm波长下测定吸光度，记为Di；用水代替水杨酸测定某浓度黄酮溶液的本底光密度Dj；用水代替抗氧化剂时测定的空白对照光密度为D[5]。

[J]清除率（S=[1-（Di-Dj/D]×100%。

1262 对DPPH的清除率[6]利用最优化方案提取的总黄酮溶液，配制不同浓度的样品溶液，分别取20 mL，再加入到5 mL容量瓶中，分别加入浓度为004 mg/mL的DPPH 溶液 20 mL，混合摇匀，反应30 min 后在520 nm 处测定其吸光度D1。以20 mL无水乙醇代替DPPH的吸光度为D2，以 20 mL 的蒸馏水代替样品溶液的吸光度为D0，以无水乙醇作参比液[6]。DPPH自由基清除率=[1-（D1-D2/D0]×100%。

2结果与分析

21不同因素对蕨菜总黄酮提取率的影响

211乙醇浓度由图1-A可知，在其他条件不变时，蕨菜总黄酮提取率开始随乙醇浓度的增大而增加，而当乙醇浓度达到80%时，总黄酮的提取率最大；当乙醇浓度再增大时，总黄酮提取率逐渐下降。

212超声波提取时间蕨菜中总黄酮的提取率在提取 10 min 之前，随时间增加而提高，至10 min时达到最大值（图1-B。

213料液比由图1-C可见，蕨菜中总黄酮的提取率在料液比为1 g ∶[G-3]40 mL时达到最大，继续增加溶剂，总黄酮的提取率反而下降。

214提取温度蕨菜中总黄酮的提取率随温度的增加逐渐增加，在60 ℃之前随温度的增加提取率的增加较快，而后随温度增加提取率也逐渐增加，但增加趋势较缓慢（图1-D。

22最佳提取工艺

正交试验结果（表2表明，从极差分析可以看出，在影响蕨菜中总黄酮提取率的4个因素中，料液比>温度>时间>乙醇浓度。最佳的提取工艺条件为：A2B2C2D3，即料液比1 g ∶[G-3]45 mL、提取温度70 ℃、提取时间20 min、乙醇浓度80%。用最佳工艺进行3次平行试验，得平均提取率为245%。

23蕨菜总黄酮对·OH的清除能力

蕨菜总黄酮对·OH的清除结果见图2。由图2可知，添加不同浓度的蕨菜总黄酮，对·OH均有清除作用，随样品浓度的增大，抗氧化性有较明显增大，当样品浓度为089 mg/L[FL]

[F（W17][TPCYQ1tif][F]

[FL（22]

时，抑制率最高，为651%，此后增加样品浓度抑制率不再增大。

[F（W17][HT6H][J]表2蕨菜总黄酮提取正交试验结果[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG42，W4，W20，W5W]试验号[B（][BHDWG12，W20W]因素

[BHDWG3，W5。4W]A：乙醇浓度B：固液比C：时间D：温度提取率（%

24蕨菜总黄酮对DPPH·的清除能力

由图3可知，蕨菜总黄酮具有清除DPPH自由基的作用，其清除能力随着浓度的增加而增大，当总黄酮浓度为 1115 mg/L 时，清除率为865%，再增加黄酮浓度，清除率变化不大。黄酮浓度与维生素C浓度相同时，蕨菜总黄酮的清除能力与维生素C相当。

[F（W10][TPCYQ3tif][F]

3结论

试验结果表明，超声辅助法中提取因素对蕨菜总黄酮提取率的影响顺序为料液比>温度>时间>乙醇浓度，最佳提取工艺条件为：料液比1 g ∶[G-3]45 mL、提取温度70 ℃、提取时间 20 min、乙醇浓度80%，最佳工艺下的平均提取率为245%。

自由基清除试验结果表明，蕨菜总黄酮具有一定的抗氧化性，且随着浓度的增加而逐渐增加。当总黄酮浓度为 089 mg/L 时，羟基自由基清除率达651%，当总黄酮浓度为1115 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为865%。endprint