牛奶过敏原检测方法研究进展

贾　　敏，张亦凡，张银志，孙秀兰，，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.陕西省汉中市产品质量监督检验所，陕西汉中723000；3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

牛奶过敏原检测方法研究进展

贾敏1，张亦凡2，张银志3，孙秀兰1，3，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.陕西省汉中市产品质量监督检验所，陕西汉中723000；3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

牛奶是八大食物致敏原之一，能引起严重的过敏反应。如何实现食物中牛奶过敏原的快速，准确筛检已成为食品安全领域关注的焦点。牛奶主要过敏原为酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白，其检测方法有电泳法、色谱法、酶联免疫实验（ELISA）、传感器、基于质谱的蛋白质组学（LC-MS/MS）、聚合酶链式反应技术（PCR）等。本文就其检测方法的原理和应用进行综述，旨在为食品中牛奶过敏原的检测提供技术方向，以便保障牛奶过敏患者的安全。

牛奶过敏原，检测，酶联免疫实验，聚合酶链式反应技术，基于质谱的蛋白质组学

食物过敏是一个全球关注的公共卫生问题，据统计，全世界约有1%～2%成人和5%～8%儿童对某些食物存在过敏反应［1］。牛奶过敏（CMA）是由于摄入乳或含有乳制品的食物而引起的异常免疫反应，在儿童中（3岁以内）引起广泛的不良反应，其发病率高达7.5%［2］。近年来随着乳及乳制品在人群中的消费量不断的增加，牛奶过敏率也在逐渐增加，牛奶过敏成为一个不容忽视的食品安全问题。牛奶蛋白含量丰富，理论而言天然牛奶含有的任何一种蛋白质都有潜在致敏性，但目前普遍认为酪蛋白（casein，CN）、β-乳球蛋白（beta-lactoglobulin，β-Lg）及α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin，α-La）是主要的牛奶过敏原［3］。

目前国内外对牛奶过敏性疾病没有彻底有效的根治方法，防止牛奶过敏的唯一有效手段是避免食入含有乳及乳制品的食物。为保护消费者健康，美国及欧盟新食品标签法规定含有牛奶成分的食品必须标示牛奶过敏原成分［4］，我国在各级食品标准中也做了相关的规定，《GB 7718-2011预包装食品标签通则》及《GB/T 23779-2009预包装食品中的致敏原成分》［5-6］均对食品过敏原标示有明确要求。因此为确保食品标签的准确性和消费者的安全，实现对食物过敏原的灵敏，可靠检测至关重要。至今为止，对食物过敏原的检测主要是基于蛋白和核酸水平的研究。基于蛋白的传统检测方法有电泳法、色谱法及酶联免疫吸附实验（ELISA）及免疫传感器等，但基于传统的电泳法、色谱法及免疫学方法往往是针对单个蛋白进行分析，其研究发展较为成熟但尚不足以满足实际需要，而近年来基于质谱蛋白质组学的运用，为实现对多种食品过敏原同时进行高通量、高灵敏度的快速检测提供了新的手段。利用液相色谱和质谱联用的方法（LC-MS/MS）可直接对致敏性蛋白进行检测或将蛋白经专一蛋白酶水解，在肽段水平间接实现过敏性蛋白的检测。伴随核酸快速检测技术研究的发展，基于DNA的特异性检测方法被引入食品过敏原成分的检验，基于核酸的检测方法主要有普通PCR、real-time PCR。

1　基于蛋白的传统牛奶过敏原检测方法

1.1电泳法

电泳是带电粒子在电场中泳动的现象。根据工作原理可分为：毛细管电泳、移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳等［7］。其中毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）在过敏原蛋白的分离检测上应用较为广泛。毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，根据样品各组分之间多种特性（电荷、大小、等电点、极性、亲和行为、分配特性等）的不同而实现分离目的的一类液相分离技术，具有高效、简单、经济、微量、自动化等优点［8］。近年来，研究人员针对毛细管电泳在牛奶过敏蛋白的检测做了深入研究。田兰［9］选择聚乙烯醇涂层毛细管，采用柠檬酸缓冲体系（pH3.0），在紫外检测214nm、分离电压20kV条件下对乳及乳制品中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白进行分离测定。结果显示五种蛋白的线性良好，相关系数均大于0.9978，加标回收率范围为88.1%～110.8%。刘一［10］研究建立了一种简单、快速、灵敏、重现性好的毛细管区带电泳（CZE）方法，利用未涂层的熔融石英毛细管为分离柱，在电压30kV，pH7.0的磷酸盐缓冲液，毛细管温度25℃，紫外检测波长205nm的条件下，2min内实现了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的基线分离和痕量检测。通过实验参数的系统优化有效解决了两种蛋白在毛细管内壁的吸附问题，实现了α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的高效分离和高灵敏检测。两种蛋白的检出限分别为3、12mg/L；线性范围为10～250、40～1000mg/L。

1.2色谱法

高 效 液相 色 谱（highperformanceliquid chromatography，HPLC）是一种基于样品分子在固相（即柱填料）和流动相（即淋洗液）之间的相互作用而实现分离的一种快速、高效的新型分析技术。因其具有高效、选择性好、灵敏度高、应用范围广等特点，已成为蛋白质物质快速分离和分析的重要手段。食物过敏蛋白的检测主要为反相高效色谱法（RP-HPLC），RP-HPLC是流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，应用范围广泛，普遍适用非极性和弱极性物质的分离。

目前，RP-HPLC分析乳清蛋白在国内外已经进行了一定的研究。朱宏［11］建立了一种快速、简便、灵敏的RP-HPLC法同时定量检测乳清蛋白中牛乳铁蛋、转基因人乳铁蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。采用Proteonavi C4色谱柱（5μm，250μm×46μm），流动相A为0.1%的三氟乙酸-水溶液，B为乙腈水溶液，梯度洗脱：流动相B最初为18%，在15min内从上升到43%，保持5min，10min升至75%，在最后15min内降到18%，流速为0.5mL/min，二极管阵列检测器，检测波长280nm，柱温35℃。结果显示5种蛋白都可以在优化的色谱条件上实现较好的分离，采用外标法定量，线性关系较好，相关系数均大于0.999。Ferreira［12］采用RP-HPLC法对牛，绵羊，山羊中的β-乳球蛋白进行定量检测，流动相同样为三氟乙酸的水溶液和乙腈水溶液。

1.3ELISA

酶联免疫吸附实验（ELISA）是以酶作为标记物，以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。它是在免疫技术基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，最早出现在20世纪70年代，具有操作简单、处理样品量大、易于标准化等优点，现阶段已经广泛应用于食品安全质量的快速筛查，并取得较好的效果。目前，应用于牛奶过敏原的ELISA检测方式主要有双抗体夹心ELISA和竞争ELISA两种。ELISA在牛奶过敏原检测方面对象有所差异，仅限用于单一致敏蛋白的检测或总蛋白的检测。布冠好［13］在制备β-Lg多克隆抗体的基础上，建立了定量检测牛乳β-Lg的间接竞争ELISA方法，检测范围在0.05～1μg/mL之间，回收率实验结果显示基于β-Lg的竞争ELISA具有较好的重现性。酶联免疫技术的特异性和灵敏度取决于抗体的特异性和效价，相对而言单克隆抗体的特异性较好，多克隆抗体的灵敏度较高。王硕［14］通过包被鼠抗酪蛋白单克隆抗体，HRP标记兔抗酪蛋白多克隆抗体，建立双抗体夹心ELISA检测牛奶过敏原酪蛋白。检测线性范围为6～1666ng/mL，相关系数为0.9949，最低检测限为7ng/mL，可计算出来牛乳中酪蛋白含量。肖海龙等［15］通过单抗和多抗的组合建立了定性检测牛奶β-酪蛋白的双抗夹心ELISA方法，最低检测限为15ng/mL且与其他蛋白无交叉反应，特异性较好。食品工业原料比较复杂，因此实际样品ELISA检测往往受到食物复杂的生物基质影响。基于此Monaci［16］以饼干为食物模型，研究了焙烤时间和基质效应对ELISA检测牛奶过敏原的影响。

ELISA技术较为成熟，目前市场上已有多种针对牛奶过敏原定性或定量检测的商业试剂盒，如Neogen、R-biopharm、Elisa Systems、WAKO等，可在短时间内实现牛奶过敏原的定性或半定量检测。WAKO的牛奶过敏原检测试剂盒，检测限为0.05μg/mL，最低定量限为0.04μg/mL，回收率在79%～122%之间。NH HAM公司牛奶过敏原检测试剂盒测定范围在0.78～50ng/mL，灵敏度达到0.78ng/mL，可在短时间内检测原材料食品和加工食品中的牛奶过敏原蛋白质。张海英等［17］对市售两种β-乳球蛋白检测试剂盒进行了比较，得出两种试剂盒对β-乳球蛋白检测的回收率，精密度均可达到ELISA检测技术要求，R-biopharm试剂盒特异性较高仅可检测牛奶中β-乳球蛋白含量，Elisa Systems试剂盒针对哺乳动物乳汁（牛、羊等中的β-乳球蛋白），不能特异性识别牛奶中的β-乳球蛋白。张霞［18］对市面上三种酪蛋白检测试剂盒进行对比实验，Elisa Systems试剂盒对羊奶酪蛋白检测结果也为阳性，Neogen和R-biopharm试剂盒均可特异性检测牛奶酪蛋白成分。

1.4生物免疫传感器

生物传感器利用生物活性物质的分子识别功能，将其识别待检物质所引起的化学或物理变化，借助转换器变换成电信号，从而实现目的物质的检测。识别原件可为蛋白、细胞、DNA等生物大分子，其特点是自动化程度高、成本低、准确敏感，能在数分钟内出结果，非专业人员即可使用，无需培训。目前已经逐渐应用于食品安全分析。免疫传感器是目前应用最为广泛，发展最为成熟的一种生物传感器。免疫传感器是以抗原抗体的特异性反应为基础，通过在电极上固定抗原/抗体，实现对抗体/抗原的检测。目前已经有技术人员将免疫传感器应用于牛奶过敏原的检测：王玲玲［19］在玻碳电极表面修饰石墨烯和壳聚糖的复合物，通过纳米金对抗体的亲和力将其固定到电极表面制成免疫传感器。在10～1000μg/L范围内线性关系良好，检测限为2μg/L。Eissa［20］在丝网印刷碳电极表面修饰石墨烯有机膜，利用石墨烯表面的氨基团和β-乳球蛋白抗体之间的共价结合将抗体固定到电极表面，利用循环伏安法（CV）进行免疫传感器电化学行为表征，差分脉冲伏安法（DPV）进行线性分析。免疫传感器的线性检测范围为1～100pg/mL，检测限为0.85pg/mL，并能特异区分卵清蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白、溶菌酶。与ELISA检测结果进行比对，结果显示ELISA和免疫传感器检测结果具有较好的相关性，进一步表明研制的免疫传感器可用于实际样品中β-乳球蛋白的检测。

2　基于蛋白质组学的牛奶过敏原检测方法

目前广泛应用于过敏原检测的方法主要是ELISA，直接检测致敏性蛋白，只能针对单个蛋白，存在特异性差，线性范围窄等缺点。在此基础上依靠质谱技术的蛋白质组学逐渐应用发展起来，可用于多个蛋白的定性或定量分析，具有高灵敏度、高分辨率、高准确度、高通量等特点［21-22］。

蛋白质组学旨在鉴定出一个细胞组织或器官中全部蛋白组成质量和数量的信息，质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟并发挥着核心作用［23］。为提高准确性质谱技术常与色谱技术联用（LC-MS/MS），将色谱的分离能力和质谱的选择能力结合起来，减少相似结构性质的蛋白质和多肽的干扰，特异性更高，避免了样品基质的干扰，可实现对复杂混合物更准确的定性或定量分析。在过敏原蛋白检测上，质谱联用技术已经广泛用于食品中花生［24］、大豆［25］、牛奶鸡蛋［26］过敏原的定性、定量检测。如何从大规模质谱数据中得出蛋白质表达水平即蛋白质定量信息一直是蛋白质组学关注的热点。定量蛋白质组学是在整体水平上研究蛋白质的定量分析，是通过比较多个样品质谱相关信息的丰度变化进行定量［27］。定量蛋白质组学有基于蛋白质本身进行的定量或肽段水平的定量。

2.1蛋白水平的定量分析

蛋白水平的定量分析，被分析物是蛋白本身，在蛋白分子量较小的情况下，蛋白直接经过质谱仪得到蛋白谱图。由于食物蛋白谱图并不复杂，因此可以利用外标法进行定量分析。Monaci等［28］利用液相色谱质谱连用法对果汁中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白（A和B）进行定量检测。利用固相萃取进行果汁样品前处理，液相色谱采用C5色谱柱，流动相A为5%乙腈水+0.1%甲酸，流动相B为95%乙腈水+0.1%甲酸，梯度洗脱，流速为0.25mL/min，柱温45℃。质谱系统由配备有大气压负离子源的三重四级杆质谱仪组成，采用多离子监测方式（MIM）进行定量分析。结果显示建立的LC-MS（MIM）方法可实现对三种乳清蛋白的同时检测，线性关系良好，相关系数大于0.995，检测范围为5～40μg/mL，检测限达到1μg/mL（S/N=3），定量限为4μg/mL（S/N＞10），将建立的方法应用于市售15种混合果汁的乳清蛋白检测，取得较为满意的结果。Czerwenka等［29］以山羊和羚羊β-乳球蛋白为内标，采用液质联用方法对牛奶中的β-乳球蛋白（A和B）进行了绝对定量。

2.2肽段水平的定量分析

蛋白经专一蛋白酶水解，可在肽段水平上间接实现蛋白的定量。利用蛋白的鉴定技术，对致敏蛋白胰蛋白酶水解后得到的肽混合物进行分析，从分析得到的肽段中选择即具有特异性，又有良好的稳定性和较高灵敏度的特征肽段（标签肽，Signature peptide）进行蛋白检测［30］。蛋白质组学在过敏原检测初期研究主要用于定性检测。Monaci［31］研究选择了酪蛋白（αs1、αs2、β、κ）的特异性肽段，以选择的肽段表征过敏原的存在，并对葡萄酒中的酪蛋白过敏原进行检测。Weber［32］以液相色谱四级杆飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF）对αs1酪蛋白酶解后肽段进行分析，选择了两个特异性肽段，应用到其他食品酪蛋白过敏原的检测。Ansariyi［33］对反刍类动物乳汁中四种牛奶过敏蛋白（α-CN，β-CN，α-La，β-Lg）的标签肽进行分析选择，实现四种蛋白的同步检测。

基于肽段的定量蛋白质组学主要分为两类：同位素标记定量技术和无标记定量技术。基于标记定量可获得较高的准确度，使用同位素标记合成的定量标签肽段作为内标物进行蛋白质绝对定量已经得到广泛应用。其原理是基于标签肽和同位素标记合成内标肽之间的分子量差异，通过检测定量标签肽和内标肽的信号强度比值进行定量分析。虽然同位素标记定量准确度较好，但其成本较高，技术难度较大。目前也有研究发现无标记定量方法与标记定量方法可达到相似的准确度，无标记定量主要是采用氨基酸序列相似的肽段作为内标。唐等［34］对同位素内标和无同位素标记内标进行了比对实验，利用LC-MS/ MS的多反应监测模式（Mulitple Reaction Monitoring，MRM）对人肿瘤细胞和组织中的NQO1蛋白进行绝对定量，结果表明非同位素内标取得和同位素标记的检测结果具有很好的相关性，可以作为现今研究较为接受的同位素标记定量方法的补充替换。李盈淳［35］也利用设计合成的肽段作为内标进行细胞内P53蛋白的定量，线性关系良好（R2=0.9993），检测范围为2.2～112.3pmol/mL。肽段水平的牛奶过敏蛋白定量检测已有报道，但尚处于起步阶段，研究较少。冯小燕［36］利用LC-MS/MS对牛奶过敏原α-酪蛋白进行检测，以OVA特征肽段作为内标，在0.5～250mg/L范围内有较好线性关系，检测限达到0.5mg/L，从奶粉、饼干、蛋黄派夹心及表面中分别检测到2092.38、104.91、74.50、14.83μg/g酪蛋白。

3　基于核酸的牛奶过敏原检测方法

聚合酶链式反应技术（PCR）是以DNA/RNA为基础发展起来的一项检测技术，经高温变性、低温退火及中温延伸等三步环节组成一个循环周期，达到目的基因特异性扩增的目的。目前PCR技术已经逐渐取代ELISA技术成为实验室和检测机构的主流检测方法，市面上也逐渐出现商业化的PCR检测试剂盒。PCR技术分为普通PCR和实时荧光定量PCR两种。普通PCR技术主要用于定性检测，检测结果需电泳验证，容易受交叉污染产生假阳性结果。在普通PCR技术基础上发展起来的实时荧光PCR通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量分析。与传统PCR技术相比，它具有特异性强、准确度高、PCR污染少、自动化程度高等优点，且无需电泳验证可实现目的基因的定量分析。关潇［37］，许庆金［38］分别建立了牛奶α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的定性PCR检测技术，为实际样品中的牛奶过敏原DNA的检测奠定了基础。目前还没有实时荧光定量PCR用于牛奶过敏原的检测报道，但它将是检测牛奶过敏原的一个具有前瞻性的发展方向。

与基于蛋白的免疫学方法相比，PCR技术的特异性引物与靶基因专一结合而与其他相似序列无法结合，特异性较高可以克服交叉反应的影响，避免对单一特异性抗体的需求。且DNA较蛋白相对稳定，在食品加工过程中蛋白容易受酶、温度、压力的影响而导致结构破坏，使得致敏性蛋白容易检测不出来，DNA比较稳定，即使蛋白被破坏也可以提取出来DNA，不会影响检测结果。因此PCR技术可以作为传统的基于蛋白的补充方法，对食品中的潜在致敏原进行快速检测。

4　结语

牛奶可引起严重的过敏反应，由于其营养价值丰富在食品中广泛存在，且在人群消费量中占很大比重，其引起的过敏问题已引起了全世界范围的关注。因此为维护食品安全和保护消费者健康，迫切需要建立快速、准确、高通量的牛奶过敏原体外检测方法。目前应用最广泛的过敏原检测方法主要是基于蛋白的传统ELISA方法和基于基因的PCR方法。ELISA方法直接检测致敏蛋白，是目前应用最为成熟的可实现标准化的检测方法。但ELISA方法具有较低复杂度的特异性蛋白识别位点，蛋白被食品中复杂的生物基质掩盖导致实验结果的不准确。蛋白在加工过程易变性，导致检测结果的假阴性，且ELISA实验只针对单一蛋白的检测。基于核酸的PCR技术相对免疫学方法具有灵敏度高，特异性强等优点。但是PCR检测的是DNA而非致敏性蛋白，检测的结果不能真正说明食物的致敏性。在此基础上需要建立一种准确、特异、高通量的检测过敏原的方法。基于蛋白质组学的LC-MS/MS为这一目标开辟了新的道路。蛋白质组学检测方法具有高灵敏、高通量、特异性强等优点，可同时对食物中的多种过敏蛋白进行同时检测。可在蛋白水平和肽段水平实现蛋白的定量，且有报道说明若选择的肽段与致敏原表位重合，可进一步说明食物的致敏性［39］。现在蛋白质组学应用于过敏蛋白的定量尚处于研究阶段，还有很多不足需要改进，但定量蛋白质组学在过敏原的检测方面具有广阔的应用前景。

虽然已有多种方法应用于牛奶过敏原检测在一定程度上能够满足灵敏度和准确性的要求。但是综合考虑灵敏度、特异性、准确度、检测限、样品量、经济成本等因素，目前还没有一种方法能够满足多样化的实际样品检测要求，但随着研究进行，检测方法也在被不断的改进，其灵敏度和准确度得到了进一步的提高。并且随着现代科学技术的不断发展，使得过敏原的检测向高灵敏度、高准确度、高通量、操作简单方向发展，为我国食品过敏原的快速检测提供技术支撑。

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Research progress of milk allergen detection

JIA Min1，ZHANG Yi-fan2，ZHANG Yin-zhi3，SUN Xiu-lan1，3，*
（1.School of Food Science of Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Hanzhong Products Quality Supervison and Inspection Institute，Hanzhong 723000，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

Milk is recognized as one of the major food allergens，which could cause severe allergic reactions. The rapid and accurate detection of milk allergen have gained tremendous attention in the field of food safety. The major allergens in milk include casein（CN），beta-lactoglobulin（α-Lg）and alpha-lactalbumin（β-La）.The currently available detection method include electrophoresis chromatography，enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），biosensor，proteomics based on mass spectrometry（LC-MS/MS）and polymerase chain reaction（PCR）.In this article，the principles and applications of major detection methods for milk allergens were summarized，which will provide guidance for the milk allergen detection in different food sources and the ensure of food safety for human health.

milk allergen；detection；ELISA；PCR；LC-MS/MS

TS252.7

A

1002-0306（2015）12-0385-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.073

2014－09－23

贾敏（1989-），女，硕士研究生，研究方向：食品安全检测。

孙秀兰（1976-），女，博士，教授，主要从事食品安全检测方面的研究。

“十二五”国家科技支撑计划（2011BAK10B03）。