新疆地方特色馕面团优良酵母菌的筛选

玛依古丽·库尔班，米尔班古丽·阿卜杜如苏力，麦合甫再木·阿不都热合曼，艾尔肯·热合曼

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046)



新疆地方特色馕面团优良酵母菌的筛选

玛依古丽·库尔班，米尔班古丽·阿卜杜如苏力，麦合甫再木·阿不都热合曼，艾尔肯·热合曼*

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046)

[目的] 筛选馕面团优质酵母菌。[方法] 从新疆乌鲁木齐、阿尔泰，喀什3个样品点采集样品，采用PDA和YEPD培养基分离纯化了馕面团发酵酵母菌，并进行了26S rDNA D1/D2 区域序列测定和系统发育分析。[结果] 试验得出，29株菌相互之间的26S rDNA D1/D2基因序列同源性比例为99%。在这29株菌26S rDNA D1/D2区序列的基础上采用邻近法构建了系统发育进化树，从中选出了11株代表菌，它们被认为是该地区特殊而独特的酵母品系，完成了初筛。进一步测定11株菌的发酵活力、发酵前后的pH与面团醒发时间，完成了复筛并获得了6株菌。接着对6株酵母菌进行了感官测试，最后获得了一株优质酵母菌K24(KM454437)，馕感官评分为 97.1 分。[结论]研究筛选出来的一株馕面团酵母菌发酵效率高，为新疆馕加工产业提供技术依据。

馕面团；酵母菌；26S rDNA D1/D2 区域；筛选

新疆独特的地理与气候环境[1]决定了以馕为中心的独特的饮食文化。 馕是以小麦面、玉米面或高梁面为原料，加少许盐水和酵面烤制而成的一种面饼，是维吾尔族的传统主食之一[2]。近年来随着我国经济的发展，人民生活水平的不断提高和生活节奏的加快，城镇居民对馕商品的需求量急剧增加，同时对馕的质量也提出了更高的要求，馕的工业化生产已成为现代社会的需求。在馕的制造过程中，馕面团发酵是一个很重要的环节，馕面团发酵最关键的是酵母菌，它与成品的质量有着密切的关系。当前制馕中馕面团发酵大都采用自然发酵或者直接采用外购普通的酵母粉，而熟知制馕工艺或者喜爱馕的人都明白酵母对于馕的口感和风味都具有重要的作用。很多新疆人都非常爱吃用传统的馕面团发酵的馕。馕面团又称老酵、酵头、老肥、面种、面头[3]，发酵是我国的传统面团发酵方法，在新疆广大城乡居民家庭中至今仍被广泛应用。这种方法成本低廉，简便易行，并且可使馕保持原汁原味。但是馕面团中大量杂菌的存在，不但具有传播病源的风险，还会导致面团发酵过酸，需要添加苏打进行中和酸味。目前常见的各种厂家生产的商品酵母粉产品虽然驰名国内外，但尚未见到能被新疆原居民广泛采用和在口感上认可的馕面团发酵酵母粉；这主要可能是馕发酵酵母是该地区保存的特殊酵母品系，它们与酵母粉制品中的酵母是不同的酵母品种或品系，因而产生的代谢产物有差异；酵母粉发酵馕饼面团导致馕饼口感变味，降低了馕饼应有的食用价值和观赏性。在我国目前对酵母菌资源的开发利用中，李自红从民间采集的馒头老酵头中分离酵母菌 25 株，筛选出制作馒头的优良酵母菌被鉴定为酿酒酵母[4]。李宝坤等从自然发酵的 5 种哈密瓜汁中分离得到 25 株酵母菌并从中筛选得到1株产酒精能力高的酿酒酵母[5]。但目前为止，国内外研究中还没发现与新疆馕面团优质酵母筛选有关的研究。采用现代微生物技术，从新疆传统的馕面团中筛选出优良的发酵酵母菌，确保馕制品的原有风味，为提高馕加工品质提供技术依据，是实现馕工业化烤制进程的必要途径，也是一个新产业发展的增长点，具有极大的社会经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 酵母菌株。2014年3月份从南北疆的3个地点采集样品，采样位点分别是：乌鲁木齐、阿尔泰、喀什。将馕面团样品放入灭菌的容器里，置于4 ℃冰箱内保存备用。

1.1.2 主要仪器。量筒(1 000 ml)；和面机(2 kg)；环保电子馕坑；PCR 扩增仪，Biometra；PHB-8型笔式 pH 计，上海虹益仪器仪表有限公司；SW-CJ-IF 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HZQ-2全温振荡器，金坛市医疗仪器厂；冷冻离心机，Thermo LEGEND MICRO 17R；凝胶成像分析仪 ALPHAIMAGERTM 2200，AlphaInnotech 公司；数控恒温水浴锅，宁波东胜仪器公司；DYY-III-3A水平电泳槽，北京六一仪器厂。1.1.3 主要原料试剂。小麦粉、土豆，从市场购买；酵母浸粉、蛋白胨、 琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、 硝酸钾、 硝酸铵、 尿素、 可溶性淀粉，天津市福晨化学试剂厂；蔗糖、 葡萄糖，天津市化学试剂三厂；均为国产分析纯。Taq酶、10×TaqBuffer、DNA聚合酶，dNTP Mixture，北京天根生化科技有限公司；通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC-GG-3′)[6]引物对，上海生工生物工程有限公司合成。1.1.4 培养基。马铃薯培养基(PDA)：马铃薯200 g，蔗糖20 g，链霉素20 mg，琼脂粉20 g，水1 000 ml(pH自然，121 ℃ 20 min)。YEPD培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，琼脂粉20 g，水1 000 ml(pH自然，115 ℃，20 min)。

1.2 方法

1.2.1 试验方案。馕面团优质酵母菌筛选工艺流程见图1。

图1 新疆地方特色馕面团优质酵母菌的筛选工艺流程

1.2.2 目标酵母菌的分离与纯化。采用梯度稀释涂布平板法进行分离，称取馕面团样品10 g，溶解于90 ml含有玻璃珠的灭菌生理盐水中，振荡30 min。分别取10-1～10-5共5个梯度浓度，每皿100 μl，涂布分离。28 ℃培养48～120 h，挑取不同形态单菌落，编号，经多次划线纯化，获得纯培养物[7]。

1.2.3 菌落形态细胞形态的观察。YEPD固体培养基上28 ℃培养48～72 h，观察其菌落形态、边缘、大小、颜色、表面及质地、侧面、透明度等特征。酵母细胞形态观察采用碱性伊红美蓝染色法[8]。将待测菌株置于28 ℃，培养2 d后挑选单个菌落进行镜检并记录细胞的微观形态(大小、形状等)特征。1.2.4 菌株基因组DNA的提取、PCR 扩增和序列测定。菌株DNA的提取采用CTAB法[9-11]。用引物NL1和NL4扩增所分离菌株的26S rDNA D1/D2区域。PCR扩增程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min，最后于4 ℃保存[12-13]。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的目标产物。所得产物委托给北京鼎国测序有限公司进行测定。

1.2.5 序列分析及系统发育树的构建。在GenBank数据库中进行同源序列搜索(BLAST search)，比较供试菌株与已知酵母菌之间的亲缘关系及GenBank 核酸序列数据库得到菌株注册号。根据相关模式菌种的D1/D2区域序列，与供试菌的序列一起，用Clustal X软件进行序列校准排齐，用Mega 5.0 软件的邻接法(Neighbor-Joining)方法，进行1 000次Bootstrap 检验后构建系统发育树[14-15]。

1.2.6 面团发酵力测定。 称量70 g揉制好的面团迅速置于500 ml 的量筒中。用木棒将其填充实于量筒底部并将面团顶部压平，记录初体积。读取体积时，将木棒伸入量筒内，使其低端轻触面团最高部位，并贴于量筒读数一侧以减小读数误差，并每隔30 min测体积增长量。记录第1小时的排水量(V1)和第4小时的排水量(V2)。用第4小时的排水量减去第1小时的排水量即为该酵母的发酵力[16]。

F(发酵力)=V2-V1

1.2.7 面团发酵前后的pH的测定。称取10 g发酵前的面团，把它放入100 ml蒸馏水内，用组织捣碎机把它匀浆，离心并过滤。用pH计对其上清液进行pH测定。称取10 g发酵后的面团，同样的方法测定发酵后的面团pH。

1.2.8 面团醒发测定。 成形后的馕饼在28～29 ℃温度下静置，观察其醒发情况。一般以达到成品体积的80%～90%为准。

1.2.9 感官测试。

1.2.9.1 和面。面粉 800 g，酵母菌 4 g，加碘精制盐10 g，消毒纯牛奶100 g，水250 ml(30 ℃)。将这些材料加入到真空和面机中，定速充分搅拌20 min。避免和面过程中人为因素造成差异。

1.2.9.2 面团发酵。将和好的面团置于醒发箱中，在28～29 ℃下进行发酵。避免发酵过程中人为因素造成误差。

1.2.9.3 馕制作按照常见的方式制作。按照成品的重量要求，将面团短时间内分块和称重，搓面和静置手工搓圆要领是掌心向下，五指握住面团，在面案上顺一方向旋转并向下轻压，将面团搓成圆球形。在27～29 ℃进行静置赤称醒发。

1.2.9.4 馕饼的烤制。将发酵好的馕面团分割成适量大小，贴入温度为150 ℃的环保电馕坑下进行打馕，烘烤。避免烤制过程中人为因素造成差异。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离 分别从乌鲁木齐、阿尔泰、喀什3个地区采集了传统馕面团样品，分离了35株面包酵母(Saccharomycescerevisiae)。

2.2 系统发育进化分析 26S rDNA的D1/D2区序列的基础上，将35株面包酵母菌测序结果与GenBank数据库中已知菌的26S rDNA D1/D2区序列进行同源性比对，针对性地选择了29株相互之间序列相似性为99%的面包酵母。用邻近法(Neighbor-joining)对29株面包酵母进行构建系统发育进化树，自展数(bootstrap)为1 000[14-15]，得到的系统发育进化树如图2所显示。

图2 相似性99%的酿酒酵母的26S rDNA D1/D2区序列的系统发育分析

2.3 初筛 根据29株面包酵母菌系统发育进化树上所展示的进化距离的不同获得了11个独立的大分支(图2)，并且从每个分支中选出了代表性的一株菌，将它作为此来源馕面团品种的代表。详细结果见表1。

以下是此试验首次筛选的11株酵母菌在基因库的注册号： K1(KM401544)，K24(KP120534)，40n(KP965903)，U10 (KP120525)，K47(KM454443)，U18(KP122529)，K28(KM454439)，K29(KP120537)，K6(KM454427)，33n(KP965907)，U5(KP120522)。

表1 11株代表面包酵母的筛选

2.4 母菌落形态与细胞形态观察 首次筛选的11株面包酵母在YEPD培养基上28 ℃下培养后其菌落形态基本上相似，颜色均为乳白色，菌落形态为圆形，边缘整齐，光滑，湿润，中部为微凸。细胞形态均为圆形，生殖方式为出芽生殖。部分菌株的菌落形态及细胞显微形态如图3所示，图中的无色为活细胞(图3c)，蓝色为死细胞(图3d)。

注：a.Saccharomyces cerevisiae n40(同40n)菌落形态；b.Saccharomyces cerevisiae U10菌落形态；c.Saccharomyces cerevisiae K28显微形态；d.Saccharomyces cerevisiae U10细胞显微形态。图3 部分供试菌株的菌落形态及细胞显微形态

2.5 复筛

2.5.1 面团体积法测定酵母发酵力。 采用体积法对11株面包酵母菌株进行发酵性能检测。产二氧化碳能力和发酵力成正比，产二氧化碳的能力越高说明该菌株发酵能力越高。从图4中可知，菌株K24、40n、U10、K47、K28、33n使面团膨发体积相当大，在馕面团中的产气能力高。该试验中获得了发酵力高的6株面包酵母。

图4 不同酵母的发酵力

2.5.2 面团的pH。表2显示的是11株菌面团发酵前后的pH，从以上结果可知它们在面团发酵前后的pH范围为5.20～5.78，不会导致馕面团过酸过碱等现象，pH不会影响馕的口味。

2.5.3 醒发测定。图5显示11株酵母菌在面团醒发时间为17～28 min。其中K24、K47、33n、K28、40n和U18醒发时间较短，非常适合于快速醒发，能够提高馕饼生产速率。

2.6 最终筛选

2.6.1 不同酵母对馕面团感官质量的影响。根据上述2次筛选，试验获得了发酵速度快、pH适当、醒发时间短的5株菌(K24、K47、33n、K28、40n)。在环保的馕坑里，175 ℃下进行打馕，并由5位评审员对馕进行感官测试。按照表3的馕感官质量评分尺度来进行打分。不同面包酵母发酵的馕感官评分结果见表4。从表4中可看出，5株面包酵母样品发酵的馕，感官评价总分平均值由高到低依次为K24、K47、K28、40n、33n。其中K24的分数最高，因此该研究中K24确定为馕面团发酵的优质菌。

表2 11株菌在发酵面团前后的pH

图5 不同菌株醒发时间

表3 馕感官质量评分标准

表4 不同面包酵母发酵的馕感官评价结果

注：酵母添加量 0.8%。

3 结论

该研究首次从新疆馕面团中筛选了优质的发酵酵母菌。根据系统发育进化树上的进化距离，选择了11株面包酵母菌。系统发育进化树上的每个大分支能够代表常见面包酵母的突变株。该试验使用体积法对面团发酵力进行检测。此法所需的设备简单、直观且可同时测定多个样品，然而家庭、作坊及工业化生产制作馒头、馕或面包时多凭经验判断，其经验的主要指标便是面团体积的变化。因此，面团体积法测定酵母发酵力的研究显得十分必要。该试验检测了面团发酵前后的pH。若馕面团对碱不足，打出来的馕会有较浓的酸味，对碱过量，馕表面发黄易开裂，风味也不好[17]。因此馕面团发酵中一定要控制pH不低于5。该试验中面团培养范围都在26～29 ℃，因为在这个温度上酵母的产气能力大，发酵力强，产气量比较均匀，面团的持气能力比较大。当温度超过30 ℃时，酵母的量大，产气的速度过快，不利于面团的持气和充分膨胀，也容易引起面团中其他杂菌的繁殖而影响面包的质量。

[1] 王连方，王生玲，张玲.新疆地理环境与地方性甲状腺肿关系剖析[J].环境科学学报，2003，23(5)：669-673.

[2] 何家兴，张全生.释“馕”[J].新疆大学学报，2011，39(5)：15-19.

[3] 丁长河，戚光册，侯丽芬，等.传统老酵头馒头的质量特性[J].中国粮油学报，2007，22(3)：18-19.

[4] 李自红.传统发酵剂微生物的筛选、鉴定及对馒头品质的影响[D].郑州：河南工业大学，2011：28-29.

[5] 李宝坤，毛晓英，陈俊，等.自然发酵哈密瓜果汁中酵母分离与鉴定[J].酿酒，2009(1)：41-43.

[6] KURTZMAN C P，ROBNELL C J．Identification and phylogeny of Ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S)ribosomal DNA partial sequences[J].Antonie van Leeuwenhoek，1998，73(4)：331-371.

[7] 沈萍，陈向东.微生物学实验[M].4版.北京：高等教育出版社，2007：14-35.

[8] 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].3版.北京：高等教育出版社，1999：42-44.

[9] NISIOTOU A A，SPIROPOULOS A S，NYCHAS G J.Yeast community structures and dynamics in healthy and botrytis-affected grape must fermentations [J].Applied and Environmental Micribiology，2007，73(21)：6705-6713.

[10] 张颖慧，魏东盛，邢来君，等.一种改进的丝状真菌 DNA 提取方法[J].微生物学通报，2008，35(3)：466-469.

[11] 昂莎莎，荚荣，卢伟.白腐真菌总DNA提取方法的研究[J].生物学杂志，2009，26(4)：82-85.

[12] WANG C X，LIU Y L.Dynamic study of yeast species andSaccharomycescerevisiaestrains during the spontaneous fermentations of Muscat blanc in Jingyang，China [J].Food Microbiology，2013，33(2)：172-177.

[13] 祝春梅，姚新奎，孟军，等.新疆自然发酵酸马奶中酵母菌的分离鉴定[J].食品与发酵工业，2013，39(4)：42-47.

[14] 周新丽，李治滢，杨丽源.云南程海湖酵母菌多样性及应用[J].微生物学报，2011，51(4)：547-553.

[15] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods [J].Molecular Biology and Evolution，2011，28(10)：2731-2739.

[16] 白玉玲，马杰，单延峰，等.酵母发酵力的简易测定方法及应用[J].粮油食品科技，2006，14(4)：55-57.

[17] 毛羽扬，朱在勤，纪有华，等.老酵面团对碱工艺最佳pH值的研究[J].中国烹饪研究，1999(2)：7-10.

Selection of Excellent Yeast for Nang Dough in Xinjiang

Marygul Kurban, Mihribangul Abdurusul, Mehfuzem Abdurahman, Erkin Rahman*

(School of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang 830046)

[Objective] To select excellent yeast for Nang dough. [Method] Collecting samples from Urumqi, Altai, Kashi in Xinjiang, the fermentation yeast for Nang dough was separated and purified with PDA and YEPD culture medium, 26S rDNA D1/D2 regional sequence determination and phylogenetic analysis was conducted. [Result] The experiment showed that, the 29 isolates’ 26S rDNA D1/D2 sequence homology was 99% each other. The phylogenetic evolution tree was constructed on the basis of 26S rDNA D1/D2 sequence and the 11 strains which were chosen by primary screening to consider as region’s special yeast strains. For further study the fermentation activity, pH and awaking time of the 11 strains were detected and the secondary screening was completed. By the sensory test finally got a high-quality yeast strain K24 (KM454437).The Nang dough fermentation yeast obtained in this study has a high quality of fermentation. [Conclusion] The obtained yeast has high fermentation efficiency, which will provide technical basis for processing industry of Xinjiang Nang.

Nang dough; Yeast; 26S rDNA D1/D2 region; Selection

乌鲁木齐市科技创新种子资金项目(21061710)； 国家自然科学基金项目(U1203101)；国家自然科学基金项目(31060002)。

玛依古丽·库尔班(1988-)，女，维吾尔族，新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，研究方向：资源微生物。*通讯作者，教授，博士，从事资源微生物研究。

2015-04-20

S 509.9

A

0517-6611(2015)17-302-04