全新含氮化合物消毒剂杀菌效果研究

王 琳，周立冬，刘谋元，刘理金，崔 辉，佟 巍，刘爱兵

化学消毒剂的使用历史悠久，杀菌效果明显，价格低廉，是临床消毒工作的重要方法之一，在防病防灾等领域已取得广泛应用[1]；其主要作用是以一定的形式对病原微生物进行杀灭，从而阻断微生物滋生条件及疾病传播途径[2]。目前，国内外常用的化学消毒剂有：含氯化合物、氧化剂类、季铵盐化合物、酚类化合物、醛类化合物、氧化电位水、醇类、银和碘化合物类等。这些消毒剂作用于人体或环境、物体表面，起消毒灭菌的效果，但对人体及环境也会产生危害，某些危害严重的消毒剂已是目前禁止使用的产品。在灾害救援领域，也存在消毒效力不足和过度消杀两大弊端，故开发新型化学消毒剂以增强消毒效力、减少对人与环境的危害已刻不容缓。全新含氮消毒剂弥补了常规消毒剂的不足，更安全、环保，本实验将对其杀菌效果进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料 试剂：主要成分为醛类衍生物、季铵盐、螯合剂、原料A的含氮消毒剂，中和剂，LEAGENE芽孢染色液，芽孢悬液，Ruitaibio营养琼脂。仪器：上海森信恒温培养箱DRP-9082、上海森信烤箱DGG-9140(A)、苏州净化超净台VS-1300L-U、吉尔森单道加样枪G23、新华蒸汽灭菌器TMQ.C5070J。

1.2 方法

1.2.1 芽孢悬液的制备 第1天：（1）营养琼脂培养基平板、营养肉汤培养基制备。（2）接种芽孢菌：取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5～10 ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养 18～24 h。第2天：用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18～24 h。第3天：挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养 18～24 h，即为第3代培养物。第4天：用10.0 ml吸管吸取5.0～10.0 ml 第3～5代的18～24 h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基平板表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养5～7 d。1周后：营养琼脂培养基平板养物，用10.0 ml 吸管加10.0 ml 无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0 ml 无菌蒸馏水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5 min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。

1.2.2 芽孢染色 （1）常规涂片。（2）滴加石炭酸复红染色液于涂片上，缓慢加热使染液冒蒸汽但不沸腾，并继续滴加热液不使涂片上的染液蒸干，维持5 min。（3）待涂片自然冷却至室温，倾去染液。用脱色液脱色至无红色染液流出为止，水洗。（4）滴加碱性美蓝染色液，复染2～3 min。（5）轻轻水洗。（6）用滤纸沿涂片边缘吸干水分，镜检。成功制备芽孢悬液，石炭酸复红染色显示芽孢被染成红色呈圆形或椭圆形小体，菌体蓝色，见图1。

图1 芽孢显色结果

1.2.3 中和剂和培养基的配制 （1）中和剂：0.3%硫代硫酸钠、0.3%卵磷脂、0.5%吐温、80的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptic soy broth，TSB)，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约7.0，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为（7.3±0.2），分装备用。（2）培养基：营养琼脂（18 g/1000 ml），加热煮沸，121℃高压灭菌25 min，培养皿10 ml分装备用。

1.2.4 消毒实验 试验组：（1）菌种准备，枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢；（2）制备浓度在1×105cfu/ml的枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢；（3）配置浓度为1%、2%、3%的含氮化合物消毒剂各12 ml为试验组1、试验组2、试验组3，每组吸取4 ml与制备好的枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢菌悬液1.0 ml混合，迅速混匀并立即计时；（4）当溶液反应至预定时间后（10、20、30 min），分别吸取0.5 ml溶液加入到4.5 ml经灭菌的中和剂中，混匀；（5）涂板，画线接种细菌。37℃，培养48 h。

对照组：（1）阳性对照用4.0 ml磷酸盐缓冲液代替4.0 ml消毒剂与1.0 ml菌悬液反应，并取0.5 ml混合液与4.5 ml的中和剂反应，进行平行实验，作为阳性对照。（2）阴性对照分别取此次实验相关的溶液（即无菌纯化水，磷酸盐缓冲液，中和剂，培养基）各1.0 ml，分别与4.0 ml磷酸盐缓冲液混匀，混匀后各取0.5 ml混合液与4.5 ml中和剂混合，进行平行试验，作为阴性对照。

实验完成后，所有实验样本送至化验室37℃恒温箱中培养48 h后计数。平均灭活对数值的计算：设阳性对照组菌落数为No，试验（消毒）组菌落数为Nx，平均灭活对数值=lg No-lg Nx。

2 结 果

2.1 消毒实验 试验组1、试验组2、试验组3分别与浓度为105cfu/ml的芽孢悬液作用10、20、30 min三个时间段，37℃培养箱培养48 h时菌落计数，见表1。

表1 琼脂板芽孢菌落计数结果

2.2 试验组平均灭活对数值 杀灭对数值就是指当微生物数量以10为底的对数表示时，灭菌前后微生物对数数量的差值[3]。平均灭活对数值 = lg No－lg Nx 计算结果显示,与对照组比较，3种浓度消毒剂均有杀死芽孢的作用，并且随着消毒剂浓度的增加，杀菌时间缩短。1%浓度消毒剂随着作用时间延长，杀菌能力增强；而2%浓度的消毒剂作用30 min，3%浓度的消毒剂作用20 min，对枯草杆菌黑色变种芽孢的清除率均达到100%。见表2。

表2 试验组不同浓度消毒剂平均灭活对数值计算结果

3 讨 论

消毒剂是指用于杀灭传播媒介上病原微生物，使其达到消毒或灭菌效果且无害化要求的制剂[4]，消毒是预防和控制传染病流行的重要措施和手段，正确掌握消毒知识，提高对消毒工作的意识和重视程度，规范正确的行为对于预防和降低传染性疾病的发生具有积极而长远的意义[5]。国际消毒行业优秀消毒剂应体现在，（1）安全：对人无害（无生物毒性） （LC50、LD50浓度很高）。（2）环保：对生产环境无污染（材质无腐蚀性）；分解产物无有害物质残留，对生态环境无害。（3）杀毒机理确切：复配技术已成为重要研究方向，复方消毒剂克服了单一消毒剂单独使用时的缺点，增加了杀菌作用。（4）杀毒效能高：高效，灭菌能力强，作用时间快。近年来，地震、洪涝等自然灾害频发[6]，研发无毒、环保的化学消毒剂在灾害救援医学领域具有重要科学意义和应用价值，同时，在日常医疗体系及民用市场领域也有重要的社会、经济效益。

本实验所用含氮消毒剂的主要成分有醛类衍生物、季铵盐等，其符合湖南省疾控中心杀菌谱-高效广谱以及卫生部安全、环保标准。季铵盐属阳离子表面活性剂，其杀菌机理主要是通过在水中形成带正电荷的物质，吸附于带负电荷的微生物表面，形成微团，通过渗透作用进入细胞膜的类脂层，改变膜的渗透性，当季铵盐浓度足够高时，胞膜非双层结构的形成可导致细胞膜的破裂和细胞内容物的渗漏[7]，阻断细菌或病毒DNA复制，完成灭菌。

影响消毒剂作用效果的因素有很多，其中，消毒剂浓度的影响至关重要[8]。本实验研究显示，与对照组比较，3种浓度消毒剂均有杀死芽孢的作用，并且随着消毒剂浓度的增加，杀菌时间缩短。1%浓度消毒剂随着作用时间延长，杀菌能力增强；而2%浓度的消毒剂作用30 min，3%浓度的消毒剂作用20 min，对枯草杆菌黑色变种芽孢的清除率均达到100%。

本实验结果表明，3%浓度消毒剂可以在较短时间内杀死枯草芽孢杆菌，适用于需要快速高效杀毒的场所或情景。地震、泥石流、洪涝等重大灾害发生时，不仅严重影响广大人民群众的生命财产安全，还会导致环境污染、传染病疫情等次生灾害。因此，在灾害发生后可使用3%浓度的消毒剂对灾害现场进行全面消杀，及时防止疫情的发生，并保障救灾工作的顺利开展。1%浓度的消毒剂能在30 min内将枯草芽孢杆菌全部杀死，因而可将其广泛应用于物体浸泡消毒、家庭保洁、园林防病治病等领域。

本实验中全新含氮消毒剂可对枯草杆菌黑色变种芽孢产生高效清除能力，但其对其他微生物是否同样具备杀灭效果还有待进一步研究。

[1]肖佳庆，李 俐，高珉之，等. 两种含氯消毒剂对枯草杆菌黑色变种芽孢杀灭效果及相关性能的实验观察[J]. 医学动物防制，2015，31（6）: 626-630.

[2]刘继敏，高贵军. 消毒剂的应用与发展前景探讨[J]. 医学动物防制，2014，30（12）:1353-1356.

[3]薛广波. 微生物消毒技术规范[M]. 北京：中国标准出版社，2010: 3-5.

[4]万新祥，曾凡林，杨 芳. 消毒剂的种类与应用[J].第一军医大学分校学报，2006，26（1）: 74-76.

[5]秦 迪，刘爱萍，申同洋，等. 社区居民消毒知识、态度及行为调查[J].中国公共卫生，2013，29（11）: 1644-1646.

[6]任 凯，解 猛，姜文汉，等. 常用化学消毒剂的作用机理[J]. 中国卫生工程学，2003，3（1）: 55-56.

[7]任 哲,饶 林,蒋 莉,等. 两种季铵盐消毒剂杀菌效果比较研究[J]. 中国消毒学杂志，2011，28（1）: 7-9.

[8]陈昭斌. 高度重视使用中消毒剂的有效浓度[J]. 中国公共卫生管理，2003，19（1）: 83-84.